鋁脅迫下不同耐鋁型桉樹無性系根和葉抗氧化特征的差異

徐圓圓，陸明英， 蔣維昕，程 飛，譚 玲，楊 梅

（1.廣西大學 林學院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 廣西高校林業科學與工程重點實驗室，廣西 南寧530004）

鋁脅迫下不同耐鋁型桉樹無性系根和葉抗氧化特征的差異

徐圓圓1,2，陸明英1， 蔣維昕1,2，程 飛1,2，譚 玲1,2，楊 梅1,2

（1.廣西大學 林學院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 廣西高校林業科學與工程重點實驗室，廣西 南寧530004）

為了闡明不同桉樹無性系對鋁的抗逆性生理響應機制，采用室內水培法，以廣西區2個桉樹無性系耐鋁型巨尾桉9號Eucalyptus grandis×E.urophylla No.9（記為G9）和鋁敏感型尾葉桉4號E.urophylla No.4（記為G4）為研究對象，在4.4 mmol·L－1鋁離子濃度下處理24 h（以pH 4.0，0.5 mmol·L－1氯化鈣為對照），從根系及葉片內細胞膜透性（CMP），丙二醛（MDA）質量摩爾濃度及過氧化氫酶（CAT），多酚氧化酶（PPO），超氧化物歧化酶（SOD），抗壞血酸過氧化物酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）等抗氧化酶活性方面探討了鋁脅迫下供試苗木的耐鋁機制。采用SPSS 21.0軟件分別對根和葉中G9和G4的各測定指標進行單因素方差分析和Duncan多重比較。根細胞膜透性、丙二醛質量摩爾濃度均顯著（P＜0.05）高于葉，鋁對2個桉樹無性系苗木的毒害主要表現在根部。在4.4 mmol·L-1鋁離子處理下，G4根相對電導率與丙二醛質量摩爾濃度最高，分別為48.8%，11.5 μmol·g－1，而G9根內過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶活性極顯著（P＜0.01）大于G4，且G9根過氧化氫酶活性比相應對照增加145.0%，G4根過氧化氫酶活性比相應對照僅增加43.0%，過氧化氫酶在G9根中對鋁毒害的緩解起到了更為重要的作用。G9清除活性氧能力較G4強，表明耐鋁型桉樹對鋁毒害具有較好的適應能力。圖7參28

林木育種學；鋁脅迫；桉樹；抗氧化酶；細胞膜透性；丙二醛

鋁是地殼中含量最高的金屬元素，約占土壤礦物質總量的7%，僅次于氧元素和硅元素，通常以難溶性的硅酸鹽和氧化物的形式存在于長石、云母、高嶺石等礦石中，對植物和環境沒有毒害作用［1］。酸性條件下（pH＜5.5），難溶性的鋁會逐漸解離轉變為有毒的離子態鋁離子（Al3+），Al（OH）2+和Al（OH）2+，酸雨的沉降加上長期施用生理酸性化肥可進一步增進土壤的酸化過程，土壤中活性鋁的增加會對植物生長造成極為不利的影響。目前，已經對玉米Zea mays，小麥Triticum aestivum，高粱Sorghum bicolor，馬尾松Pinus massoniana，杉木Cunninghamia lanceolata，桉樹Eucalyptus，柚木Tectona grandis等農林作物開展了有關鋁毒害及耐鋁毒機制的研究［2］。鋁對植物的危害主要是通過抑制植物根系的生長，進而影響根系對水分和養分的吸收，最終影響植物的生長和發育［3］。不同植物或同種植物不同基因型對鋁毒的耐性存在著一定的差異［4］。鋁會對植物細胞產生氧化損傷，而這些損傷可以得到抗氧化酶的保護［5］。植物器官在鋁脅迫下受到傷害時往往會發生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化過程的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受酸鋁傷害的程度。植物體內的過氧化物酶（POD），過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），多酚氧化酶（PPO），抗壞血酸過氧化物酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）等是重要的抗氧化酶，在清除金屬等誘發產生的氧自由基和過氧化物、抑制膜脂過氧化、保護細胞免遭傷害等方面起著重要作用。在許多作物抗性機制研究中，這類抗氧化酶活性的變化已廣泛作為指示植物抵御逆境傷害的指標［6］。目前，關于鋁處理下抗氧化系統的變化多集中在農作物及經濟作物方面，而有關林木方面的研究相對較少。桉樹具有豐產、優質、適應性強、用途廣泛等特點。目前，中國桉樹人工林面積已達300萬hm2，廣西是其主要栽培區之一［7］。桉樹人工林生產力的維持與養分供應有很大關系，持續施肥可加劇土壤酸化，使土壤活性鋁不斷增多［8］。西班牙桉樹林土壤中鋁含量及桉樹根系中鋁的積累受土壤酸度影響，且存在潛在的鋁毒危險性，赤桉E.camaldulensis，藍桉E.globulus，巨桉E.grandis，鄧恩桉E.dunnii等實生苗在鋁脅迫下分泌蘋果酸、檸檬酸和草酸［9］，低濃度鋁離子甚至會促進桉樹生長［10］。筆者曾對4個速生桉優良無性系（巨尾桉9號E.grandis×E.urophylla No.9，巨尾桉12號E.grandis×E. urophylla，尾葉桉4號E.urophylla，韋赤桉3號E.wetarensis×E.Camaldulensis No.3等的耐鋁性進行了研究，結果為巨尾桉9號具有較強的耐鋁性，而尾葉桉4號的耐鋁性較差，且耐鋁桉樹無性系根部鋁的積累量較低［11－12］。在此基礎上，本研究進一步探討了不同耐鋁型桉樹無性系在根、葉器官中對鋁的抗性生理響應差異，為闡明桉樹耐鋁機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

以2月生速生桉無性系組培苗巨尾桉9號（G9）及尾葉桉4號（G4）為試驗材料，修剪留根長4.0 cm，去根基向上1/3葉以便固定植株。試驗苗浸入1.0‰多菌靈溶液消毒30 min后，用自來水沖洗凈。移入盛有約2.5 L營養液的塑料桶中，用剪成圓形的珍珠棉泡沫板做固定材料，分4孔·板－1，5株·孔－1，此外板中央留1孔通氣。使用Hoagland營養液（pH 5.5）［13］進行培養，3 d更換培養液1次，并用1.0‰多菌靈溶液消毒5 min，用2.0 mol·L－1鹽酸及氫氧化鈉將營養液的酸度從pH 5.5以0.1降幅逐級調至pH 4.0，持續7 d后轉入pH 4.0，0.5 mmol·L－1氯化鈣中清洗1 d。采用完全隨機試驗設計，取長勢優良、大小一致的桉樹苗進行鋁處理。本課題組前期檢測5年生桉樹人工林林地土壤可溶性鋁的平均濃度為4.4 mmol·L－1［12］。參照楊振德等［14］進行的鋁對桉樹幼苗生長影響的研究，當鋁質量濃度為120.0 mg·L－1時，僅有1株桉樹幼苗存活，被認為是耐鋁性較強的單株。因此，鋁離子濃度設為 4.4 mmol·L－1

（以AlCl3·6H2O形式加入），以pH 4.0，0.5 mmol·L－1氯化鈣為對照（ck），處理24 h后測定相關指標。試驗期間營養液容器密閉遮光處理，增氧電泵全天通氣。

1.2 指標測定方法

取中間部位葉片、根尖3 cm以內根系0.2 g，葉片用蒸餾水沖洗3次，根系在0.5 mmol·L－1氯化鈣溶液中清洗30 min，以洗脫樣品表面的鋁殘留，再用去離子水沖洗3次以除去表面的電解質，吸干水分后剪碎，細胞膜透性（CMP）采用電導率儀測定［15］，用相對電導率（%）表示。

參照陳建勛等［16］方法提取酶液。其中，丙二醛（MDA）提取方法為取桉樹苗木中間部位葉片、根尖3.0 cm以內根系0.5 g，加體積分數為5%的三氯乙酸（TCA）2.0 mL，研磨至勻漿，再加8.0 mL三氯乙酸充分研磨，勻漿以4 000 r·min－1離心20 min，上清液即為樣品提取液。抗氧化酶液提取方法為取桉樹苗木中間部位葉片、根尖3.0 cm以內根系0.5 g于預冷的研缽中，加10.0 mL pH 7.0,0.05 mol·L－1磷酸緩沖液、0.1 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及少許石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，于4℃ ，5 000 g下離心20 min，上清液即為過氧化氫酶（CAT）提取液/抗壞血酸過氧化物酶（APX）提取液/超氧化物岐化酶（SOD）提取液/多酚氧化酶（PPO）提取液/谷胱甘肽還原酶（GR）提取液。

試驗參照陳建勛等［16］測定丙二醛質量摩爾濃度及酶液活性。丙二醛質量摩爾濃度用硫代巴比妥酸（TBA）法測定，單位為 μmol·g－1。過氧化氫酶活性采用過氧化氫（H2O2）法測定，酶活力以1 min變化0.01個吸光度值D（240）所需酶量為1個活性單位，以U·min－1·g－1（1 U=16.67 nkat）表示；抗壞血酸過氧化物酶活性采用紫外吸收法測定，酶活力以1 min變化0.01個吸光度值D（290）所需酶量為1個活性單位，以U·min－1·g－1（1 U=16.67 nkat）表示；超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑比色法測定酶活力以四唑氮藍（NBT）被抑制50%為1個酶活性單位，以鮮質量酶單位每克表示（U·g－1，1 U=16.67 nkat）；多酚氧化酶活性采用鄰苯二酚法測定，酶活力以1 min變化0.01個吸光度值D（400）所需酶量為1個活性單位，以U·min－1·g－1（1 U=16.67 nkat）表示；谷胱甘肽還原酶采用紫外分光法測定，酶活力以1 min變化0.01個吸光度值D（340）所需酶量為1個活性單位，以U·min－1·g－1（1 U=16.67 nkat）表示。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel和SPSS 21.0等軟件對數據進行單因素方差分析，并分別對根和葉中G9和G4的各測定指標進行Duncan多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 鋁處理對2個桉樹無性系細胞膜透性的影響

圖1顯示：2個桉樹無性系根相對電導率均比葉高；G4根電導率最大，4.4 mmol·L－1鋁離子處理下為48.8%，細胞膜透性顯著（P＜0.05）增大，而G9變化不明顯，但G9葉片的電導率則與對照有極顯著（P＜0.01）差異；G4和G9根電導率分別為相應對照的1.3倍和1.2倍，葉電導率分別為相應對照的1.2倍和1.5倍；可見2個無性系在鋁處理下細胞受損情況不一樣，同一個無性系根系和葉片表現不同。

2.2 鋁處理對2個桉樹無性系丙二醛質量摩爾濃度的影響

圖2所示：G4根及葉內丙二醛質量摩爾濃度均較G9大，4.4 mmol·L－1鋁離子處理下桉樹根及葉內丙二醛質量摩爾濃度均有顯著（P＜0.05）增加；G4根丙二醛質量摩爾濃度最大，為11.5 μmol·g－1，且其變化幅度最大，比相應對照增加46.0%，G4葉、G9根及葉內丙二醛質量摩爾濃度變化相對較小，均小于20.0%。

2.3 鋁處理對2個桉樹無性系過氧化氫酶活性的影響

圖3顯示：4.4 mmol·L－1鋁離子處理下G9根及葉內過氧化氫酶活性均顯著（P＜0.05）大于G4，G9根及葉過氧化氫酶活性變化幅度較大，分別比相應對照增加145.0%和43.0%，差異極顯著（P＜0.01）；而G4根和葉的過氧化氫酶活性變化不明顯，并在鋁處理后其根過氧化氫酶活性受到抑制。

2.4 鋁處理對2個桉樹無性系抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

圖4所示：G9根內抗壞血酸過氧化物酶活性顯著（P＜0.05）大于G4，而葉內的抗壞血酸過氧化物酶活性則相反；在4.4 mmol·L－1鋁離子處理下， G4根、葉內抗壞血酸過氧化物酶活性均有極顯著（P＜0.01）變化，分別增加92.9%和30.7%；而G9根抗壞血酸過氧化物酶活性變化不大，葉抗壞血酸過氧化

物酶活性則增加了35.4%，差異極顯著。G4根抗壞血酸過氧化物酶活性增幅達到G9的5.6倍，表明其在G4根部清除活性氧的過程中起到重要作用。

圖1 鋁處理下不同桉樹無性系根、葉細胞膜透性的變化Figure 1 Changes of CMP in 2 eucalyptus seedling roots and leaves under aluminum-induced

圖2 鋁處理下不同桉樹無性系根、葉丙二醛質量摩爾濃度的變化Figure 2 Changes of MDA in 2 eucalyptus seedling roots and leaves under aluminum-induced

圖3 鋁處理下不同桉樹無性系根、葉過氧化氫酶活性的變化Figure 3 Changes of CAT in 2 eucalyptus seedling roots and leaves under aluminum-induced

圖4 鋁處理下不同桉樹無性系根、葉抗壞血酸過氧化物酶活性變化Figure 4 Changes of APX in 2 eucalyptus seedling roots and leaves under aluminum-induced

2.5 鋁處理對2個桉樹無性系超氧化物歧化酶活性的影響

圖5所示：G4根及葉內超氧化物歧化酶活性均顯著（P＜0.05）大于G9，且其增幅均較G9大。4.4 mmol·L－1鋁離子處理下，G4根及葉超氧化物歧化酶活性變化幅度較大，分別為相應對照的1.9倍和1.7倍，差異極顯著（P＜0.01）；G9根超氧化物歧化酶活性顯著（P＜0.05）大于對照，而其葉中超氧化物歧化酶活性變化較小；2個桉樹無性系均表現出根內超氧化物歧化酶活性較葉大。

2.6 鋁處理對2個桉樹無性系多酚氧化酶活性的影響

圖6所示：G4根中多酚氧化酶活性顯著（P＜0.05）高于G9。在4.4 mmol·L－1鋁離子處理下，G4和G9根的多酚氧化酶活性均與相應的對照有顯著（P＜0.05）差異，其中G4的多酚氧化酶活性最高，為488.9×16.67 nkat·min－1·g－1，增幅達49.5% ，且顯著大于G9根多酚氧化酶活性。而2個無性系的葉多

酚氧化酶活性較穩定，均沒有明顯變化。

圖5 鋁處理下不同桉樹無性系根、葉超氧化物歧化酶活性變化Figure 5 Changes of SOD in 2 eucalyptus seedling roots and leaves under aluminum-induced

圖6 鋁處理下不同桉樹無性系根、葉多酚氧化酶活性變化Figure 6 Changes of PPO in 2 eucalyptus seedling roots and leaves under aluminum-induced

2.7 鋁處理對2個桉樹無性系谷胱甘肽還原酶活性的影響

在4.4 mmol·L－1鋁離子處理下，2個無性系根谷胱甘肽還原酶活性均被抑制，G4根谷胱甘肽還原酶活性降幅比G9大2.5倍。其中G4根谷胱甘肽還原酶活性最低（7.1× 16.67 nkat·min－1·g－1），明顯受到抑制，而G9根谷胱甘肽還原酶活性下降幅度不顯著。葉部谷胱甘肽還原酶活性較穩定，在鋁處理下均沒有顯著的變化，但G4降低而G9有所增加（圖7）。

圖7 鋁處理下不同桉樹無性系根、葉谷胱甘肽還原酶活性變化Figure 7 Changes of GR in 2 eucalyptus seedling roots and leaves under aluminum-induced

3 討論與結論

3.1 討論

在逆境或脅迫條件下，植物對環境中鋁離子的吸收及鋁在植物不同器官中的分布因不同植物而異，一般植株吸收的鋁大部分積累在根中，只有很少量部分轉運到地上部分，脅迫下根系受鋁毒害更嚴重［17－18］。鋁離子進入桉樹植株體內后，主要集中在桉樹根部［19］。在4.4 mmol·L－1鋁離子處理下，桉樹根系反應敏感，其相對電導率、丙二醛質量摩爾濃度的變化程度比葉片的高。由于鋁離子直接作用于根部，使根部細胞受到較重傷害，膜透性增強，電解質外滲多［20－21］，巨尾桉9號的根部細胞透性變化較小，表現出其耐鋁的特征。

根部細胞的抗氧化系統對鋁脅迫起到重要的防御作用，能有效阻止活性氧在植物體內的積累，其活性的升降反映了植物在逆境因子作用下通過自身防御機制對環境脅迫做出保護性應激反應［22］。在耐鋁的巨尾桉9號和鋁敏感的尾葉桉4號中，根中抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性均有顯著增加，且增幅較葉明顯，而過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶則在葉中變化幅度較大。植株受害后其體內抗氧化酶系統做出反應，通過過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、谷胱甘肽還原酶等協同作用來減緩鋁的毒害，超氧化物歧化酶將O2－歧化成過氧化氫和氧氣，緊接著過氧化氫酶將過氧化氫轉化為水和氧氣，多酚氧化酶是清除多余的氧氣，抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶能通過抗壞血酸（AsA）-谷胱甘肽-NADPH循環，催化AsA氧化，清除過氧化氫和氧離子（O2－）［23］。

在鋁脅迫下，桉樹植株體內的抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶起到重要的抗氧化作用。

鋁脅迫下植物體內保護酶活性高低與植物鋁毒耐性成正相關，且抗氧化酶在抗鋁處理上具有一定的協同性［24－27］。耐鋁基因型巨尾桉9號在鋁誘導下抗氧化系統比較活躍，消除活氧能力較強，其根和葉過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶活性顯著大于尾葉桉4號，超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性較尾葉桉4號小，這可能與不同耐鋁性的無性系活性氧生成量有關。尾葉桉4號產生較多的活性氧，而激發了超氧化物歧化酶活性，而巨尾桉9號的活性氧少，而且在清除過氧化氫和氧離子后期時，過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶活性較大，對氧化損傷具有較高的保護作用。植物器官在逆境條件下，耐受型品種有較高的抗氧化酶活性［28］。巨尾桉9號細胞膜透性沒有受到鋁脅迫的顯著影響，且其膜脂過氧化程度也較低，其自身細胞膜系統較穩定，對于緩解鋁離子的毒害作用起到重要的防身作用，而且其抗氧化酶的協同作用能有效清除自由基，減輕了對膜的破壞，維持質膜的正常通透性。

今后可對不同濃度梯度及脅迫時間梯度的鋁脅迫下不同耐鋁型桉樹無性系根系與葉片生理生化指標的變化過程進行進一步研究，并在多個桉樹種植區域對桉樹人工林地鋁含量及形態進行測定，將室內試驗結果與田間試驗相結合，闡明桉樹人工林鋁脅迫情況，對桉樹在中國南方酸性土壤的栽植、提高林地利用率及保證人工林的可持續發展提供理論依據。

3.2 結論

2個桉樹無性系根、葉的相對電導率、丙二醛質量摩爾濃度及過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、谷胱甘肽還原酶等活性在不同部位對鋁處理的響應程度不一致。鋁對桉樹苗木的毒害主要表現在根部，根中抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性變化幅度較大，而過氧化氫酶在根和葉中變化趨勢相似，谷胱甘肽還原酶在根中受到抑制，所以抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶主要在根中起作用，過氧化氫酶在根和葉中起同等重要的作用，谷胱甘肽還原酶則在葉中對活性氧的清除起有更為重要的作用。

4.4 mmol·L－1鋁離子處理下，根和葉丙二醛質量摩爾濃度均顯著高于對照；巨尾桉9號根和葉相對電導率、丙二醛質量摩爾濃度及其葉內變化幅度均低于尾葉桉4號，巨尾桉9號根和葉過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶活性顯著大于尾葉桉4號，超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性較尾葉桉4號小；耐鋁性較強的巨尾桉9號膜質過氧化程度較低，其根內過氧化氫酶及葉過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶活性顯著增強，可更有效地消除膜脂過氧化產生的活性氧，同時其根和葉的超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性又低于敏感品種，說明巨尾桉9號產生的活性氧較少及褐化水平較低，且消除活氧能力較強，比尾葉桉4號具有更高的抗氧化水平。

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Al stress with lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in eucalyptus roots and leaves

XU Yuanyuan1,2,LU Mingying1,JIANG Weixin1,2,CHENG Fei1,2,TAN Ling1,2,YANG Mei1,2
（College of Forestry,Guangxi University,Nanning 530004,Guangxi,China;2.Key Laboratory of Forestry Science and Engineering of Guangxi,Guangxi University,Nanning 530004,Guangxi,China）

Eucaplytus is the main timber tree species in south China with enrichment of aluminum（Al）in soil, but the physiological mechanisms of Al tolerance in eucalyptus trees is not well understood.To clarify the physiological response mechanism of Al resistance of eucalyptus,seedlings of the two eucalyptus genotypes（Eucalyptus grandis×Eucalyptus urophylla No.9,Al-resistant type,designated G9;E.urophylla No.4,Al-sensitive type,designated G4）were grown for 24 hours in 0.5 mmol·L－1CaCl2solutions（pH 4.0）containing 0 and 4.4 mmol·L－1Al respectively.The indexes of plant stress resistance were measured by cell membrane permeability（CMP）,malondialdehyde content（MDA）,catalase activities（CAT）,polyphenol oxidase（PPO）,superoxide dismutase（SOD）,ascorbate peroxidase（APX）,and glutathione reductase（GR）in the roots and leaves. The significance of data was analyzed with one-way Anova and Duncan multiple comparison by SPSS 21.0 system.The contents of CMP and MDA in the roots were significant higher（P＜0.05）than those in the leaves indicating that Al toxicity mainly happened in the roots of the two eucalyptus genotypes.With 4.4 mmol·L－1of Al stress in the roots of G4,the highest relative electrical conductivity was 48.8%and MDA content was 11.5

forest tree breeding;aluminum stress;eucalyptus;antioxidant enzymes;cell membrane permeability;malondialdehyde

S722.3

A

2095-0756（2016）06-1009-08

2015-11-05；

2015-11-28

國家自然科學基金資助項目（31070560）；廣西自然科學基金資助項目（2015GXNSFAA139081）

徐圓圓，從事森林培育研究。E-mail：xuyuan829475@163.com。通信作者：楊梅，教授，博士，從事森林培育研究。E-mail：fjyangmei@126.com

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.012

μmol·g－1.CAT,APX,and GR activities in roots of G9 were extremely significant higher （P＜0.01）than G4. CAT play an important role in the detoxification of reactive oxygen species in Al-tolerant eucalyptus clone,because it rose by 145%in the roots of G9 in response to Al treatment,only rose by 43%in G4.Conclusively, the Al-resistant eucalyptus genotype G9 was adapted to Al toxicity with active physiological characteristics to remove reactive oxygenresistant.［Ch,7 fig.28 ref.］