Cd2+處理后麻雀腦組織中糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)變化

索麗娟, 羅磊, 高學(xué)斌, 趙洪峰

(1.陜西省動(dòng)物研究所，西安710032；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710119)

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Cd2+處理后麻雀腦組織中糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)變化

索麗娟1, 羅磊1, 高學(xué)斌1, 趙洪峰2*

(1.陜西省動(dòng)物研究所，西安710032；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710119)

目的 檢測(cè)在Cd2+處理后糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR)在麻雀Passermontanus腦組織中的表達(dá)變化。方法 6只麻雀隨機(jī)分成2組，每組3只。處理組飲水中添加500 μg·L-1Cd2+,對(duì)照組不添加。用ClustalW2將麻雀的GR和MR氨基酸序列與其他物種氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析。采用Real-time PCR檢測(cè)基礎(chǔ)水平下麻雀各組織中GR和MR基因的表達(dá)水平。Cd2+處理后，測(cè)定GR和MR基因在腦組織中的表達(dá)變化。結(jié)果 麻雀與斑胸草雀Taeniopygiaguttata和原雞Gallusgallus的GR和MR氨基酸序列的相似性大于90%；GR和MR基因在麻雀肝臟、腸、心臟、眼球、腦、肺、肌肉、腎臟和性腺9個(gè)組織中均有表達(dá)；Cd2+處理后，處理組腦組織中GR和MR mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 GR和MR在麻雀各組織中廣泛表達(dá)；推測(cè)GR和MR基因在Cd2+的應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用，具體作用還有待于進(jìn)一步論證，同時(shí)該研究為野外工作提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

糖皮質(zhì)激素受體；鹽皮質(zhì)激素受體；麻雀;基因表達(dá)；應(yīng)激

鳥類是野生動(dòng)物的一個(gè)重要類群，是食物鏈中的高級(jí)消費(fèi)者。鳥類廣泛分布于不同生態(tài)環(huán)境以及生態(tài)環(huán)境中的不同生態(tài)位，生活史較為復(fù)雜，壽命較長，體溫高，代謝速率快，從環(huán)境中獲取物質(zhì)相對(duì)多，對(duì)自然環(huán)境變化較為敏感(Donaldetal.，2001；Gregoryetal.，2005)。另一方面，鳥類生理行為(內(nèi)分泌和組織發(fā)育)對(duì)于重金屬污染物有顯著的響應(yīng)(Janssensetal.，2003；Burger & Eichhorstetal.，2005，2007；Carereetal.，2010)，因而常被作為環(huán)境污染的代表性指示物種。

重金屬鎘(Cd)是動(dòng)物體內(nèi)的非必需元素，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有激素效應(yīng)，對(duì)生殖和內(nèi)分泌功能有較大的影響(Messner & Bernhard，2010)。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，Cd2+被大量釋放，對(duì)環(huán)境造成了污染。通過測(cè)定鳥體組織(Burger & Eichhorst，2005；張丹等，2013；Luoetal.，2015)中重金屬的含量可以反映鳥類所處環(huán)境中的重金屬濃度。但該方法不足以反映重金屬污染的實(shí)際毒理效應(yīng)，所以本研究擬從分子水平上探討重金屬污染對(duì)鳥類的影響。

長期的Cd2+污染對(duì)鳥是一種慢性應(yīng)激刺激，Cd2+往往通過取食、飲水、呼吸等途徑在鳥體內(nèi)積累。鳥類應(yīng)激反應(yīng)的最早表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)濃度升高(Sapolskyetal.，2000；Romero，2004)。GC由腎上腺分泌，是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)軸激活的終產(chǎn)物，同時(shí)可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)HPA軸，抑制HPA軸的活性(Aguilera，1998)，也可以動(dòng)員能量儲(chǔ)備，調(diào)節(jié)一系列激素的合成和作用，抑制免疫系統(tǒng)功能，并促進(jìn)避害和自我維持行為(Wingfield & Kitaysky，2002；鄧瓊，2014)，其功能的發(fā)揮往往依賴糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptors，GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptors，MR)(Duetal.，2014)。GR和MR作為核受體可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄(基因組反應(yīng))(Oitzletal.，2010)，同時(shí)也可以介導(dǎo)快速的非基因組反應(yīng)(Groenewegetal.，2011，2012)。在脊椎動(dòng)物中，GR和MR的核苷酸和氨基酸序列高度保守(Kwoketal.，2007；Okaetal.，2013)。斑胸草雀TaeniopygiaguttataGR和MR的部分DNA片段已經(jīng)被克隆(Hodgsonetal.，2007)，并成功預(yù)測(cè)出全長cDNA，且正確性已經(jīng)被表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag)技術(shù)證實(shí)(Warrenetal.，2010)。

麻雀Passermontanus是一種常見的雜食性雀形目留鳥，數(shù)量龐大，分布廣泛，且易于獲取，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)技術(shù)成熟，所以被選為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。首先，將麻雀的GR和MR氨基酸序列與其他物種的進(jìn)行相似性比較；其次，通過Real-time PCR測(cè)定基礎(chǔ)水平下GR和MR基因在麻雀不同組織中的表達(dá)狀況；然后比較Cd2+處理前、后麻雀腦組織中GR和MR基因表達(dá)的變化。本研究旨在探討秦嶺水域附近麻雀體內(nèi)GR和MR基因表達(dá)水平變化能否作為監(jiān)測(cè)秦嶺水源涵養(yǎng)區(qū)重金屬污染的敏感標(biāo)志物之一，并為其提供實(shí)踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 6只麻雀購于陜西省西安市朱雀路花鳥魚蟲市場(chǎng)，體質(zhì)量19.6～20.3 g，均健康無病，飼養(yǎng)在陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成2組，每組3只。處理組飲水中含有500 μg·L-1Cd2+，對(duì)照組不添加Cd2+。實(shí)驗(yàn)期間，麻雀可以自由取食飲水，食物(帶殼的谷子)充足，每日換水3次(早、中、晚)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa)，氯仿(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，異丙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Amresco)，瓊脂糖(Biowest Agarose)，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，Taq酶(TaKaRa)，普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，SYBR?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa)。

1.1.3 主要儀器 CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測(cè)儀(Bio-Rad)，高速冷凍離心機(jī)(Thermo)，Nanodrop分光光度計(jì)(Thermo)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 飼養(yǎng)15 d后處死麻雀，解剖取其肝臟、腸、心臟、眼球、腦、肺、肌肉、腎臟和性腺9個(gè)組織，液氮澆凍研磨。研磨后按RNAiso Plus試劑盒說明書提取麻雀各組織RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品濃度和OD260/OD280值。樣品存于液氮中備用。

1.2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄 用DEPC水稀釋每個(gè)RNA樣品濃度至1 μg·μL-1。以此為模板按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Real-time PCR反應(yīng)檢測(cè)體系

根據(jù)GenBank中報(bào)道的麻雀GR(登錄號(hào)：KJ414462.1)和MR(登錄號(hào)：KJ414463.1)基因序列，利用Primer 5設(shè)計(jì)引物，由上海華大基因科技有限公司合成(表1)。

利用CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測(cè)儀對(duì)各基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系如下：0.5 μL 20 μmol·μL-1的上、下游引物，1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，12.5 μL SYBR?PremixExTaqTMⅡ，10.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；在最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后做熔解曲線，溫度65 ℃～95 ℃。同一樣品重復(fù)3個(gè)反應(yīng)。結(jié)果采用2-△Ct和2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析，以β-actin作為內(nèi)參基因?qū)Y(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 實(shí)驗(yàn)引物的相關(guān)信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 麻雀GR和MR氨基酸序列相似性分析

在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中獲得8個(gè)物種GR和MR的氨基酸序列，采用ClustalW2進(jìn)行相似性分析(表2)。結(jié)果表明，麻雀與斑胸草雀、原雞Gallusgallus的氨基酸序列相似性較高，均高于90%，與斑馬魚Daniorerio的相似性最低，僅為54.70%。

2.2 GR和MR基因在基礎(chǔ)水平各組織的表達(dá)分析

采用Real-time PCR檢測(cè)到GR和MR mRNA在麻雀各組織中均有表達(dá)，其在心臟和肌肉中的相對(duì)表達(dá)量高于其他組織，肝臟、眼球、腦和肺次之，腸、腎臟和性腺較低。腦中的相對(duì)表達(dá)量與其他各組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

表2 麻雀與其他8個(gè)物種糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體氨基酸序列的比對(duì)

圖1 在麻雀不同組織中糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR) mRNA的相對(duì)表達(dá)量(結(jié)果用2-△Ct分析)

2.3 Cd2+對(duì)麻雀腦組織GR和MR基因表達(dá)的影響

在飲水中加入500 μg·L-1Cd2+15 d后，處理組麻雀腦組織中GR和MR mRNA的表達(dá)水平均上調(diào)，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖2)。

圖2 Cd2+對(duì)麻雀腦組織中糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR) mRNA表達(dá)量的影響 (結(jié)果用2-△△Ct分析)

3 討論

GR和MR因參與GC的下游調(diào)控而備受關(guān)注。ClustalW2分析結(jié)果表明，麻雀的GR和MR氨基酸序列與其他鳥類、魚類、兩棲類、爬行類和哺乳類存在相似性。與斑胸草雀的相似性最高，這與它們同屬于雀形目是相對(duì)應(yīng)的。另外，有研究表明，GR和MR在家麻雀P.domesticus和斑胸草雀中廣譜表達(dá)并且參與應(yīng)激反應(yīng)(Schmidtetal.，2010；Lattin & Romero，2014)，推測(cè)麻雀的GR和MR基因也具有類似的分布特征和功能。

對(duì)麻雀基礎(chǔ)水平下GR和MR基因的組織表達(dá)分析是研究這2個(gè)基因功能的重要基礎(chǔ)工作。本實(shí)驗(yàn)隨后測(cè)定了麻雀不同組織中GR和MR mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Real-time PCR結(jié)果分析顯示，GR和MR在麻雀的9個(gè)組織中均有表達(dá)，與家麻雀(Lattinetal.，2012)和斑胸草雀(Schmidtetal.，2010)的研究結(jié)果類似，且在肌肉、心臟中表達(dá)較高。總體來說，在具有代謝功能的組織中GR和MR表達(dá)相對(duì)較高，如肝臟是糖異生的主要場(chǎng)所，腎臟是第二場(chǎng)所，肌肉中可以產(chǎn)生糖異生的底物——氨基酸，這些組織可能參與應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的能量動(dòng)員。

應(yīng)激反應(yīng)中，GC的濃度會(huì)隨著機(jī)體生理、環(huán)境和社會(huì)等因素的變化而變化(Lattinetal.，2012)。GC通過與GR和MR結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，并且這2種受體與GC的親和力不同。MR與GC的親和力高于GR，低水平GC優(yōu)先與MR結(jié)合，高水平GC優(yōu)先與GR結(jié)合(Oitzletal.，2010)。高水平的GC與GR結(jié)合之后，GR被激活，GR-GC復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)下游促炎轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而達(dá)到抗炎的效應(yīng)(de Kloetetal.，2005)。另外，在代謝性組織(肌肉、肝臟、脂肪等)中GR-GC可以與GC應(yīng)答元件結(jié)合，促進(jìn)參與糖異生、蛋白分解和脂肪分解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(Poletietal.，2015)。哺乳動(dòng)物大腦富含GR和MR，而GR和MR共同參與HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié) (Rozeboometal.，2007；Oitzletal.，2010)。在應(yīng)激反應(yīng)中，大腦中的MR主要負(fù)責(zé)維持神經(jīng)元的完整性和穩(wěn)定性(Oitzletal.，2010)，GR通過抑制HPA的過度反應(yīng)使GC恢復(fù)到基礎(chǔ)水平(Tasker & Herman，2011)。為了解Cd2+處理后，麻雀腦組織中GR和MR的表達(dá)變化，本實(shí)驗(yàn)在麻雀飲水中添加500 μg·μL-1Cd2+15 d后，對(duì)其腦組織中MR和GR mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示GR和MR mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)。有研究表明，MR過表達(dá)的雄性轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的GC水平低于正常小鼠，由此可見，MR過表達(dá)可能會(huì)降低GC水平(Kanatsouetal.，2015)。綜上所述，推測(cè)上調(diào)的MR和GR mRNA都有可能降低GC濃度并使其恢復(fù)到正常的水平。隨著時(shí)間的延長，GC是否會(huì)恢復(fù)到正常水平，長時(shí)間Cd2+刺激是否會(huì)引起大腦的病理變化，還有待進(jìn)一步研究。

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Expression of Glucocorticoid Receptors and Mineralocorticoid Receptors in the Brain ofPassermontanusafter Cadmium Treatment

SUO Lijuan1, LUO Lei1, GAO Xuebin1, ZHAO Hongfeng2*

(1.Shaanxi Institute of Zoology, Xi’an 710032, China; 2.College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Objective The expression levels of glucocorticoid receptors (GR) and mineralocorticoid receptors (MR) were measured in the brain ofPassermontanusafter cadmium treatment.Method SixP.montanuswere randomly divided into 2 groups.Treatment group was fed with water of 500 μg·L-1Cd2+.Alignment of amino acid sequence of GR and MR was performed using the ClustalW2.Real-time PCR was performed to study the baseline expression levels of GR and MR among different tissues.Finally, the expressions of GR and MR were determined in the brain ofP.montanusafter cadmium treatment.Result The result of amino acid sequence alignment showed that the GR and MR ofP.montanushad high similarity withTaeniopygiaguttataandGallusgallus(>90%).Real-time PCR results showed that the GR and MR expressed in all of nine detected organs and tissues.Compared with the control, the expression levels of GR and MR were significantly up-regulated after cadmium treatment (P<0.05).Conclusion The GR and MR were widely expressed in tissues ofP.montanus.GR and MR might play a significant role under the cadmium stress.This research provided the experimental evidence for fieldwork.

glucocorticoid receptors; mineralocorticoid receptors;Passermontanus; gene expression; stress

2015-11-05 接受日期：2016-03-02 基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)院重大項(xiàng)目(2013K-01); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372201)

索麗娟(1985—), 女, 碩士, 研究實(shí)習(xí)員, 研究方向： 秦嶺水源涵養(yǎng)區(qū)水質(zhì)污染對(duì)鳥類毒性效應(yīng), E-mail：slj1030@163.com

*通信作者Corresponding author，男, 副教授, E-mail：zhaohf@snnu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20150346

Q786; Q959.7

A

1000-7083(2016)03-0409-05