DNA條形碼及其在生物多樣性研究中的應用

陳煉， 吳琳， 王啟菲， 吳軍， 劉燕， 丁暉， 徐海根*

(1. 江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，南京210013； 2. 環境保護部南京環境科學研究所，南京210042)

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DNA條形碼及其在生物多樣性研究中的應用

陳煉1， 吳琳1， 王啟菲1， 吳軍2， 劉燕2， 丁暉2， 徐海根2*

(1. 江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，南京210013； 2. 環境保護部南京環境科學研究所，南京210042)

DNA條形碼是利用生物體內標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段對物種進行快速準確鑒定的技術。自2003年DNA條形碼相關概念提出以來廣受關注，國內外相繼開展了DNA條形碼及信息系統建設研究，為DNA條形碼技術的發展提供了堅實的研究基礎和生物信息學分析平臺。DNA條形碼技術彌補了傳統分類學的不足，為生物多樣性研究提供了新的思路和方法。本文介紹了DNA條形碼的產生與發展過程，國內外DNA條形碼技術與信息系統建設研究進展，重點闡述了DNA條形碼技術在物種鑒定、瀕危物種保護、隱存種發現、生物多樣性評估等研究領域中的應用。最后結合DNA條形碼技術目前存在的問題，對其在相關研究領域的應用前景進行了展望。

DNA條形碼；生物多樣性；分類學；物種鑒定

DNA條形碼是利用生物體內一段標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段對物種進行快速準確鑒定的技術(Hebertetal.,2003a)。該技術極大地增強了人類監測、了解和利用生物多樣性資源的能力，其在生命科學、法醫學、流行病學，以及醫藥、食品質量控制等領域均有廣泛的應用前景。DNA條形碼技術彌補了傳統分類學的不足，為生物多樣性研究提供了新的思路和方法。本文圍繞DNA條形碼的產生與發展及其在生物多樣性研究中的應用展開論述。

1 DNA條形碼的產生與發展

1.1 DNA條形碼的定義

生物學研究以準確的物種鑒定為基礎，在樣品保存良好的前提下，傳統分類學家依靠已有的理論知識和實踐經驗對物種進行鑒定。隨著人們對物種鑒定要求的逐步提高，傳統形態學鑒定已不能滿足相關需要，并且傳統形態學鑒定具有一定的局限性，例如：容易忽略類群中普遍存在的隱存分類單元，用作鑒定的特征可能存在表型可塑性及遺傳可變性，這些都會導致鑒定錯誤(Hebertetal.,2003a)。而隨著傳統分類學專家隊伍的縮減，能否準確、快速地進行物種鑒定成為分類學必須突破的瓶頸。

Hebert等(2003b)對動物界包括脊椎動物和無脊椎動物共11門13 320種的線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome coxidase Ⅰ，COⅠ)基因序列進行比較分析。除刺胞動物Cnidaria外，98%的物種種內遺傳距離差異小于1%，很少超過2%，而種間平均遺傳距離差異可達到11.3%。Hebert等(2003a)應用線粒體COⅠ基因序列鑒定了鱗翅目Lepidoptera 200個近似物種，并提出將線粒體COⅠ基因序列作為全球動物鑒定系統的核心標記基因片段。

同傳統的形態學鑒定相比，DNA條形碼技術具有以下優勢：(1)不受物種發育階段的影響：以物種DNA序列為檢測對象，同種生物在不同生長時期的DNA序列信息一致；(2)操作簡單：該技術對研究人員的分類知識與經驗要求不高，經過簡單培訓即可操作，不需要依賴分類學專家；(3)準確性高：每個物種都具有特定的DNA序列信息，利用現有的DNA條形碼數據庫，可鑒別出全球范圍內已收錄的所有物種；(4)能夠發現傳統形態學鑒定所不易發現的新種或隱存種(Smithetal.,2006)。目前，DNA條形碼技術已經成為生物分類和物種鑒定強有力的工具，在生物多樣性保護中得到了廣泛的應用(Janzenetal.,2009)。

DNA條形碼技術雖然發展前景廣闊，但對于保存年代久遠的博物館館藏標本，要獲得其標準的DNA條形碼序列比較困難，因其DNA大多已降解。DNA微型條形碼(DNA minibarcode)是指長度為100～200 bp的DNA序列(Meusnieretal.,2008)，而對于已降解的標本，200 bp左右的序列也可以用于擴增。如Hajibabaei等(2006b)的研究表明約130 bp的DNA微型條形碼可以有效地被應用于蛾類干制標本的鑒定。Meusnier等(2008)設計了1對通用引物Uni MinibarF1/Uni MinibarR1用于擴增COⅠ基因的一段130 bp的片段，在1 866個樣本中(包括哺乳類、魚類、鳥類和兩棲類的691種共1 566個樣本和植物、真菌、藻類的300個樣本)的擴增成功率高達92%。

1.2 DNA條形碼的候選基因

動物DNA條形碼研究通常選擇線粒體COⅠ基因為候選基因，它是一段長度約為650 bp的基因片段，具有長度適宜、進化速率適中等特點，序列的種間差異能較好地區分物種。研究表明，利用COⅠ基因序列能夠對北美哥斯達黎加地區1 000多種熱帶鱗翅目昆蟲進行有效的區分(Hajibabaeietal.,2006a)；利用線粒體COⅠ基因序列對澳大利亞207種海洋魚類進行分析，發現COⅠ基因在魚類鑒定中具有良好的通用性，能夠對魚類進行有效的物種鑒定(Wardetal.,2005)；在兩棲類的條形碼研究中，16S rRNA基因和COⅠ基因(Vencesetal.,2005a，2005b)曾被提出作為適用于兩棲類的條形碼基因。同COⅠ基因相比，16S rRNA基因高度保守。盡管16S rRNA基因有時也作為兩棲類的條形碼標記，但在鑒定物種方面沒有COⅠ基因有效。Xia等(2012)利用COⅠ基因和16S rRNA基因鑒定來自小鯢科Hynobiidae的54種130個個體。盡管16S rRNA序列的擴增成功率高于COⅠ基因，但由于其進化速率太慢，不能提供足夠的信息從而更有效地鑒定山溪鯢屬Batrachuperus、擬小鯢屬Pseudohynobius和小鯢屬Hynobius的部分物種。Che等(2012)重新設計和優化了2對COⅠ通用兼并引物，在中國兩棲類的11科36屬82種111個個體中進行了驗證，證實新設計的2對引物能夠較廣泛地用于兩棲類DNA條形碼研究。Nagy等(2012)重新設計了RepCOⅠ-F/RepCOⅠ-R引物，對馬達加斯加地區的468種爬行類的擴增成功率高達84.6%，可大規模地應用于爬行類的DNA條形碼研究。

植物的DNA條形碼研究一般采取的候選基因有matK、rbcL、trnH-psbA、ITS序列。matK基因具有進化速率快、長度適中、種間差異度較高和堿基轉換/顛換頻率較低等特點。rbcL基因易于擴增，但進化速率較慢，物種間水平變異較小(CBOL Plant Working Group，2009)。trnH-psbA基因長度適宜，進化速率快，且該片段的引物通用性好、擴增成功率高，對蘭科Orchidaceae植物的識別率高達90%(Shawetal.,2005； Lahayeetal.,2008)。Kress和Erickson(2007)提出了rbcL+trnH-psbA基因組合片段的建議，以提高物種鑒別率，結果表明僅采用rbcL基因中的一小段rbcL-a基因在種水平上的識別率為76.3%，trnH-psbA基因的識別率為83%，而將二者結合識別率高達95%。復合序列相較單個序列具有更高的適用性和鑒別力，因此受到研究者的廣泛關注。在2007年9月舉行的第二次國際生命條形碼大會上，與會者提出通過擴增多種片段組合來彌補單位點序列的不足。Lahaye等(2008)單獨使用matK基因或結合trnH-psbA基因作為條形碼對1 600多種植物的基因組DNA進行擴增，識別物種成功率高達90%以上。CBOL Plant Working Group(2009)對7種最常用的單個基因序列進行綜合評估，以matK+rbcL基因組合作為植物通用條形碼復合序列，對397個不同科屬的樣本進行鑒定，成功率達到72%。Nithaniyal等(2014)使用rbcL和matK基因作為DNA條形碼，研究了印度熱帶干旱常綠闊葉林地區114個屬的樹葉，發現rbcL+matK組合對物種的識別率可高達98%以上。目前植物DNA條形碼中rbcL、matK和ITS為核心條形碼(CBOL Plant Working Group，2009；China Plant BOL Groupetal.,2011)，trnH-psbA為補充條形碼(Pangetal.,2012)。近年來，也有學者提出將葉綠體全基因組作為“超級條形碼”(super-barcode)應用于植物物種鑒定(Kane & Cronk，2008)。同傳統的DNA條形碼(序列長度一般為300～700 bp)相比，葉綠體基因組全序列長達110～160 kb，包含足夠的變異信息以達到種下等級分辨率的優勢，具有更高的分辨率和準確度(Kaneetal.,2012；楊慧潔等，2014)。隨著第二代測序技術的發展和測序成本的降低，已有越來越多植物葉綠體全基因組序列的報道(Lietal.,2015；Curcietal.,2016)。單分子實時測序技術也開始應用于植物葉綠體基因組測序中(Lietal.,2014)。基于葉綠體基因組序列的“超級條形碼”進行物種鑒定將受到越來越廣泛的關注。

微生物DNA條形碼研究中，主要采用ITS基因作為真菌候選基因。國際真菌DNA條形碼工作組通過對多個基因序列進行篩選評價，發現了ITS序列可使真菌物種的分辨率達到72%，是目前真菌物種分辨率最高的單一DNA片段(張宇，郭良棟，2012)。ITS序列是核糖體中的一段DNA片段，包括ITS1、ITS2和5.8S 3個常用的DNA序列片段，在真菌和可進行光合作用的真核生物中廣泛存在，具有很高的種間差異性。ITS的優點在于片段長度適宜、引物通用性強、便于擴增(Seifert，2009)。2011年，第四屆國際生命條形碼大會建議將ITS基因作為真菌DNA條形碼的首選。而細菌一般采用擴增16S rRNA基因，該基因具有更易擴增的特點，在原生生物中表現尤為明顯(Migliettaetal.,2009)。

1.3 DNA條形碼的發展

1.3.1 DNA條形碼相關的項目和網站 DNA條形碼概念自2003年由加拿大生物學家Hebert提出以來發展迅速，許多國家和組織建立了項目和網站(表1)。2003年3月，分子生物學家、生物信息學家以及分類學家們在美國召開了“DNA與分類學”主題研討會,Hebert等提出對全球所有物種的某個基因進行大規模測序，實現物種鑒定。同年9月，在“以分類學DNA與生命條形碼”為主題的研討會上，提出了國際生命條形碼計劃(International Barcode of Life，iBOL)。iBOL旨在擴大生命條形碼數據庫(Barcode of Life Database，BOLD)中條形碼的地理分布和物種分類信息，同時存儲已生成的條形碼，提供條形碼所代表的信息并確保全球可以共享這些信息。2004年，美國科學家Schindel和Miller發起并成立了生命條形碼協會(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)，并與美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立合作關系，二者將標準的條形碼序列和相關信息存檔在GenBank中。2009年，國際生命條形碼計劃啟動，來自50多個國家近200多個組織加入并同意把他們的條形碼數據公布在公共數據庫中。

1.3.2 國際DNA條形碼研究 DNA條形碼數據庫不僅是存儲樣品信息和DNA條形碼序列的工具，也是DNA條形碼研究和物種鑒定分析的生物信息學平臺，對促進和推動DNA條形碼研究發展具有重要意義。2007年5月10日，世界上第一個DNA barcoding鑒定中心——安大略生物多樣性研究所(Biodiversity Institute of Ontario)在加拿大圭爾夫大學成立。第一個國際DNA條形碼數據系統由CBOL于2007年建立。該系統是生命條形碼領域最全面和最有效的數據管理系統，主要功能包括收集、保存、分析和利用世界范圍內產生的DNA條形碼數據。迄今為止已經有252 961個物種，5 002 427條DNA條形碼序列(2016年6月)的相關記錄。BOLD中不但收集DNA條形碼序列數據，還規范了有關物種分類、樣品采集、標本保存、標本圖片和測序質量文件等要求。iBOL得到很多國家和地區的支持，共建立了3種不同類型的節點，包括國家、地區和中心節點。亞太地區共7個國家參與構建(中國、澳大利亞、印度、韓國、俄羅斯、新西蘭和巴布亞新幾內亞)，其中，中國為中心節點；俄羅斯為地區節點；巴布亞新幾內亞為國家節點。2010年1月在日本名古屋召開的《生物多樣性公約》第十次締約方會議(The 10th Conference of the Parties to the Convention on Biological Diversity，CBD-COP10)上，iBOL與CBD正式締結合作關系。全球分類計劃(Global Taxonomic Initiative，GTI)提出將DNA條形碼作為一項完善分類學的工具(http：//www.cbd.int/decision/cop/?id=12305)。此外，國際上還有多個針對特定動物類群的條形碼數據庫，例如：哺乳動物生命條形碼行動(Mammalia Barcode of Life Campaign；http：//www.mammali-abol.org)，該行動旨在構建一個面向全球哺乳動物的綜合性DNA參考文庫；鱗翅目生命條形碼(Lepidoptera Barcode of Life；http：//lepbarcoding.org)旨在構建全部蚜蟲和蝶類物種的COⅠ條形碼文庫；魚類生命條形碼行動(Fish Barcode of Life Campaign；http：//www.fishbol.org)旨在收集30 000種以上世界范圍內魚類的條形碼，且每個物種至少包括5個標本；歐盟檢疫性有害生物DNA條形碼數據庫Q-bankife，是由荷蘭植病專家Peter Bonants發起并聯合歐盟成員國科研人員，針對歐盟檢疫性有害生物建立的DNA條形碼信息系統，能對昆蟲、入侵植物、細菌、真菌等有害生物進行檢疫。

1.3.3 我國DNA條形碼數據庫建設與項目研究 中國生命條形碼信息管理系統由中國科學院微生物研究所自主開發，迄今收錄了47 914個樣本，總計55 225條序列。該系統收錄來源于BOLD的所有公開數據，可以便捷地獲取來源于BOLD的公開數據，并管理自己的DNA條形碼數據，為DNA條形碼數據在世界范圍內的數據共享做出了貢獻(陳巖等，2014)。中國檢疫性有害生物DNA條形碼信息系統于2012年正式對外開放，由憑證標本庫、數字標本庫和DNA條形碼數據庫組成。DNA條形碼系統架構在Linux+TomcaLinux+Tomcat+PostgreSQL的平臺上，平臺服務器的操作系統是Linux，網站服務平臺是Tomcat，數據庫服務平臺是PostgreSQL。系統是基于JAVA語言的SSH(Struts+Spring+Hibernate)框架開發的。2013年12月，由中國科學院植物研究所構建的“中國珍稀瀕危植物DNA條形碼鑒定平臺”(http：//www.brep.ac.cn)正式啟用，這是一個社會公益性平臺，目的是讓全社會能利用科學研究成果。該平臺提供多種DNA條形碼鑒定途徑，達到準確鑒別未知珍稀瀕危植物的目的。2015年11月5日，由中國科學院昆明動物研究所開發的“中國兩棲類信息系統”正式上線，標志著中國兩棲類物種有了屬于自己的DNA條形碼數據庫，該信息系統共收錄中國兩棲類物種3目12科61屬429種，對每一個物種都進行了專業介紹。該系統還可進行“在線物種鑒定”，后臺數據庫已包含2 048條COⅠ基因序列，覆蓋302個物種。

此外，我國還大力開展了許多DNA條形碼項目研究，例如2012年啟動的“十二五”“863”計劃、“基于DNA條形碼的快速檢測與分類關鍵技術”，通過選擇我國珍稀藥用物種資源、野生物種資源、主要農作物資源和環境指示型生物等，來研制DNA條形碼檢測技術和相關試劑產品，并構建上述生物物種的基因條形碼標準數據庫，建立我國重要生物遺傳資源的DNA條形碼網絡服務體系及基于DNA條形碼技術的快速檢測方法和分類平臺。中華人民共和國科學技術部國家科技基礎性工作專項——“我國重要漁業生物DNA條形碼信息采集及其數據庫構建”重點項目于2013年6月啟動，旨在拓展DNA條形碼技術在漁業新資源開發、種質資源評價、水產育種、水產品質量安全和有害入侵物種控制等方面的應用。迄今為止已經建立了具有漁業生物特色的DNA條形碼技術；采集并保存了漁業生物標本11 067份，獲得漁業生物DNA條形碼2 447條，建立了初具規模的漁業生物憑證標本庫和DNA條形碼數據庫；工作專項——“《中國植物志》的數字化和DNA條形碼”于2013年11月啟動，以《中國植物志》、FloraofChina和中國高等植物物種信息等研究成果為核心，將植物分類學以及相關學科的最新研究成果整合，利用計算機和現代網絡信息技術集成傳統分類、分子系統學和DNA條形碼等信息，更新和提升數字化的《中國植物志》，構建網絡協同工作平臺，初步實現我國維管植物科屬級水平鑒定信息系統，構建新一代智能植物志(iFlora)；2014年啟動的工作專項——“我國近海海洋生物DNA條形碼資源庫構建”由中國科學院海洋研究所承擔，根據不同類群的特點，選擇有代表性的重要海洋生物類群，如原核生物、植物、浮游動物、大型底棲無脊椎動物及魚類等，在形態學準確鑒定的基礎上，系統并規模化地獲取DNA條形碼序列。國家自然科學基金委員會重大項目——“DNA條形碼標準基因的進化和隱存生物多樣性研究”，基于DNA條形碼序列探索新種和隱存種的理論和方法，通過篩選新的動物DNA條形碼標準基因，研究標準基因的變異規律，為不同動物類群標記基因的選取及設計提供理論依據。

表1 部分DNA條形碼相關項目及簡介

2 DNA條形碼在生物多樣性研究中的應用

2.1 生物多樣性保護

2.1.1 物種鑒定 隨著經濟的發展，珍稀瀕危物種棲息地日益遭到破壞，對生物多樣性的保護刻不容緩。開展瀕危物種的保護研究首要任務就是對物種進行準確鑒定。DNA條形碼技術結合形態學鑒定更為準確客觀(Hajibabaeietal.,2006a；郭銳等，2012)。Li等(2015)對中國境內分布的嚙齒目Rodentia鼠亞科Murinae和田鼠亞科Arvicolinae部分物種進行首次大規模系統的DNA條形碼鑒定研究。該研究分析了四川地區鼠亞科31個種和田鼠亞科23個種的線粒體COⅠ基因片段，發現DNA條形碼可以準確識別物種并可以完善系統的嚙齒目物種鑒定工作。但是其中一種BLOG數據分析方法需要建立在正確的形態學鑒定的基礎上，對物種的鑒定成功率才能達到100%，這表明在DNA條形碼研究中對物種進行完全的分類和準確的形態學鑒定同樣重要。形態學鑒定粉虱(Hemiptera：Aleyrodidae)成蟲很困難。Ovalle等(2014)分析了9種若蟲階段和成蟲階段的粉虱COⅠ基因序列(約709 bp)，發現DNA條形碼技術可以實現對粉虱的快速鑒定，當結合限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術時可以節省測序費用并充分區分不同粉虱之間的變異，更有效地監控粉虱的傳播。

DNA條形碼不僅被成功應用于動物物種鑒定，在植物鑒定中也發揮較大作用(Sassetal.,2007)。Pei等(2011)和裴男才(2012)利用DNA條形碼從熱帶雨林或亞熱帶常綠闊葉林中一些林冠層物種的葉片或樹皮中提取DNA，能夠對相關物種進行快速準確鑒定。Xie等(2014)將DNA條形碼技術應用于中國74種有毒植物，使用生物信息學分析方法評估matK、rbcL和ITS序列對植物的辨識度，證明DNA條形碼技術是一種可以快速鑒定有毒植物的方法，并建議matK、rbcL和ITS 3種基因結合作為DNA條形碼技術鑒定有毒植物的條形碼基因。Naeem等(2014)通過棕櫚科中10個物種的葉片樣本評估matK和rbcL基因對棕櫚科植物的鑒別，結果表明這2種條形碼基因均顯示出較高的擴增成功率，基于matK基因對棕櫚科植物的鑒別力高達90%，比rbcL基因(66.6%)更適合作為棕櫚科植物鑒定的標準條形碼。

2.1.2 瀕危物種的保護 DNA條形碼技術準確、快速的特點使其能夠有效地被應用于瀕危物種的保護。Holmes等(2009)對澳大利亞附近海域非法捕撈的不明來源的211個魚鰭樣品進行物種鑒定，發現多數鯊魚屬于被列為世界自然保護聯盟(IUCN)紅色名錄的鼬鯊屬Galeocerdo、真鯊屬Carcharhinus、檸檬鯊屬Negaprion，還發現樣品中包括極度瀕危物種——鈍鋸鰩Anoxypristiscuspidata。DNA 條形碼作為一種快速簡便的識別鑒定方法在瀕危植物的保護中也得到較好的應用。Zuo等(2011)為了鑒別瀕危物種人參屬Panax的物種，使用DNA條形碼技術對人參屬8種的95個樣本進行研究：基于11個候選基因(atpF-atpH、trnH-psbA、psbK-psbI、psbM-trnD、matK、rps16、rpoB、rpoC1、rbcL、nad1、ITS)片段的序列分析，發現trnH-psbA和ITS基因組合足以鑒別人參屬的所有物種。Sosa等(2013)評價不同條形碼基因對墨西哥20種瀕危蘭科和36種竹亞科Bambusoideae植物的鑒別力，結果表明僅使用matK基因即可對墨西哥瀕危蘭科植物鑒定到種，而使用psbI-K基因結合matK基因可對竹亞科植物鑒別到屬。

2.1.3 發現隱存種 傳統的分類鑒定方法并不能夠準確地揭示種群之間的遺傳分化(Saitohetal.,2015)，而DNA條形碼不受主觀判斷影響的限制，不僅可以揭示物種之間的遺傳分化，還能發現新種與隱存種，有利于生物多樣性的保護。Saitoh等(2015)基于線粒體COⅠ基因序列分析了日本列島的234種鳥和歐亞大陸的142種鳥，發現日本列島及其周邊的24種鳥類可能是隱存種，這與日本列島周圍的海洋和海峽的基因阻隔作用有關。該研究表明傳統的鳥類分類方法在對東亞鳥類進行鑒別時不能完全反映其中的差異性，而COⅠ基因在鑒定鳥類時具有很高的分辨率，可以成為鑒別鳥類物種的有效工具。Efe等(2009)用線粒體COⅠ、Cytb等基因對瀕危物種——白嘴端燕鷗Thalasseussandvicensis進行研究，發現了該種鳥類的2個隱存種，為保護該珍稀鳥類提供了新方向。Liu等(2011)基于植物DNA條形碼的5個候選基因(rbcL、matK、trnH-psbA、trnL-F、ITS)對分布于歐亞的11種紅豆杉屬Taxus植物進行了研究，研究表明單獨使用ITS、trnL-F基因或組合可以作為鑒定最可靠的條形碼，同時確定了歐亞的紅豆杉屬植物可能存在隱存種。這一結論也得到了居群遺傳學(Liuetal.,2013)和形態學(M?lleretal.,2013)的支持。Lahaye等(2008)在使用8種條形碼對中美洲和南美洲的1 600多種植物進行分析時不僅證明了DNA條形碼在生物多樣性中的適用性，而且在使用matK基因進行數據分析時發現其中一種捧心蘭Lycastecf.tricolor可能存在隱存種。

2.2 生物多樣性評估

DNA條形碼技術也是開展生物多樣性評估和物種鑒定研究有效的工具(Yanetal.,2015)。傳統的蝙蝠生物多樣性野外調查主要依賴于形態學上的鑒定和蝙蝠探測器裝置的使用，但傳統的鑒定方法耗時耗力，而且蝙蝠探測器無法對特定物種進行監測造成資源浪費。Wilson等(2014)在缺乏物種信息的情況下，基于線粒體COⅠ基因序列對翼手目4屬(Rhinolophus、Hipposideros、Murina、Phoniscus)的13個個體進行物種鑒定，發現DNA條形碼可以完全區分這13種翼手目動物，更加準確地評估ɑ多樣性和β多樣性。Chen等(2015)收集怒江流域46種形態不同的1 139個魚類個體，通過NJ樹、條形碼指數(Barcode Index Numbers，BINs)、間隙條形碼發現(Automatic Barcode Gap Discovery，ABGD)等方法鑒定出43個物種，并且發現在棒花魚Abbottinarivularis、高體鳑鲏Rhodeusocellatus、大鱗副泥鰍Paramisgurnusdabryanus這3個入侵物種的種內可能存在隱存種。

DNA條形碼技術不僅可以對當前的生物多樣性進行分析，也可以對過去的生物多樣性進行分析。Willerslev等(2007)對從格蘭陵島冰帽底部收集到距今約45萬年的粉末狀樣品進行分析，發現格蘭陵島南部在那時有森林覆蓋，植被主要由云杉屬Picea、榿木屬Alnus、松屬Pinus組成。此外，DNA條形碼技術還能作為了解生物體之間營養相互作用的工具，尤其是難以進入的棲息地，如森林根冠及地下區域。Jones等(2011)對巴拿馬巴羅科羅拉多島熱帶雨林的土樣進行收集，利用DNA條形碼鑒定根的種類，通過將在DNA條形碼基礎上對根的鑒定和樹木個體空間的記錄結合起來，得出的結論反映了植被之間的關系，并能夠據此重建植物群落的地上與地下關系。

隨著第二代測序技術的發展，基于DNA條形碼技術水平上的生物多樣性分析更為經濟方便。整合了DNA高通量測序和DNA條形碼技術的DNA metabarcoding技術，通過提取環境樣品中的DNA，并使用特異性引物進行PCR擴增，對擴增產物測序后得到的操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)進行物種鑒定。該技術具有準確性高、成本低、對所取樣品量要求低等優點，在食性分析、物種監測、外來入侵物種的監測方面得到了較廣泛的應用，也為生物多樣性評估提供了高效有力的分析方法。Thomsen等(2012)利用環境DNA metabarcoding技術研究海洋魚類生物多樣性，在獲得的環境DNA中發現了15種不同的魚類以及4種鳥類，其中包括一些用傳統監測方法很難發現的稀有物種。與9種傳統的海洋魚類調查方法比較，環境DNA檢測出的魚類多樣性與其他傳統方法相當，甚至優于傳統方法。Evans等(2016)使用環境DNA metabarcoding技術對模擬條件下的水體生態群落進行研究，發現物種豐富度和測序讀長豐富度存在正相關關系，表明環境DNA metabarcoding技術在量化自然環境水體中的物種多樣性上有很大潛力，并且該技術可作為衡量大型底棲動物豐富度的指數。最近，Crampton-Platt等(2015)基于第二代測序技術對來自婆羅洲雨林的500個甲蟲標本的混合樣品進行測序，獲得175個物種的全部或部分線粒體基因組。利用這些樣本分析獲得的系統進化樹與基于全球鞘翅目Coleoptera主要支系現有的線粒體基因組構建的系統進化樹高度相似。結果表明線粒體宏基因組可作為新的DNA“超級條形碼”用于研究節肢動物及其他生物多樣性的全球模式。

3 展望

鑒于單基因在類群中通用性不高的因素，多基因片段聯合的DNA條形碼鑒定系統已經成為一個探索的趨勢。隨著DNA metabarcoding、DNA微型條形碼、宏條形碼等的發展，以及DNA條形碼數據庫的不斷完善，DNA條形碼技術將在生物多樣性研究領域得到更廣泛的應用。

在出入境檢驗檢疫以及鑒定外來入侵物種等方面，傳統形態學鑒定需要花費大量時間，很難進行快速檢疫，DNA條形碼技術為檢驗檢疫及鑒定外來入侵物種提供了新的工具。2011年，“基于DNA條形碼的快速檢測與分類關鍵技術”被納入中國高技術研究發展計劃(“863”計劃)。其次，DNA條形碼技術在中藥材鑒定中也有著廣闊的應用前景，能夠對藥材真偽進行鑒定(陳士林等，2013)，在生物監管領域具有廣泛的應用空間。使用DNA條形碼技術不但能在棲息地喪失之前創建生物多樣性的庫存，而且有助于生物多樣性的保護。DNA條形碼鑒定具有快速、簡便、不受外界環境變化而改變等優勢，隨著測序技術的迅速發展，鑒定成本不斷下降，相信在未來將會具有更廣泛的應用。

DNA條形碼技術的發展給生物學研究帶來了許多機遇，但尚未解決自身局限性所帶來的問題，比如核內假基因的存在會導致DNA條形碼進行物種鑒定時出現錯誤，使用通用引物對DNA進行條形碼擴增時，這些假基因會協同擴增進而導致對物種數量估計過高(Songetal.,2008)。Song等(2008)利用蝗蟲和小龍蝦研究了假基因對DNA條形碼鑒定產生的影響，發現假基因導致條形碼過高估計了物種數目。此外，近緣物種間的雜交或基因滲入及某些新近形成物種序列差異極小等問題會導致線粒體基因沒有積累足夠的變異來區分物種(戴傳銀等，2010)。Ermakov等(2015)發現歐亞大陸地區的4種黃鼠(Spermophilusfulvus、S.major、S.pygmaeus和S.erythrogenys)存在線粒體DNA基因滲入，例如在S.fulvus中發現有16.6%個體有S.major的單倍型，5%的S.pygmaeus個體有S.fulvus的單倍型，COⅠ基因的單倍型有不同程度的重疊，無法正確鑒定這4個物種。Feng等(2013)應用DNA條形碼鑒別中國西部的楊屬PopulusL.物種，結果發現DNA條形碼對那些分布區重疊或是相鄰區域的物種無法鑒別，這可能是由于種間雜交或基因滲入、不完全譜系分選(incomplete lineage sorting)導致。

DNA條形碼技術同樣面臨著取樣問題，研究表明地理分布較遠的同種生物因共生體的不同會導致線粒體DNA序列的差異變大，出現一個物種具有多個不同的條形碼(Inglebyetal.,2013)。研究過程中取樣的數量也會對鑒定結果產生影響(李超等，2014)。此外，存在足夠大小的條形碼間隙(barcoding gap)是DNA條形碼準確鑒定物種的前提之一。而隨著技術的發展與研究的深入，已發現條形碼間隙在有些類群中并不明顯，甚至出現了種內差異和種間差異重疊的現象(趙廣宇等，2014)。同時，在DNA條形碼研究過程中應嚴格遵循綜合分類學(integrated taxonomy)的理念(Willetal.,2005)。

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Application of DNA Barcoding in Biodiversity

CHEN Lian1， WU Lin1， WANG Qifei1， WU Jun2， LIU Yan2， DING Hui2， XU Haigen2*

(1. College of Life Sciences， Chemistry and Chemical Engineering， Jiangsu Second Normal University， Nanjing 210013， China;2. Nanjing Institute of Environmental Sciences， Ministry of Environmental Protection， Nanjing 210042， China)

DNA barcoding is a technology for accurate and rapid identification of species by analyzing standard short DNA sequences with enough variation in the organism. The concept of DNA barcoding has attracted widespread attention since 2003. More and more projects focused on DNA barcoding and information system construction have been carried worldwide， and provide a solid foundation and bioinformatics analysis platform for the development of DNA barcoding. DNA barcoding makes up for the shortcomings of traditional taxonomy and provides new ideas and methods for biodiversity research. Here we provided a brief introduction for the research progress of DNA barcoding， and reviewed its applications and advances in species identification， endangered species protection， cryptic species， and biodiversity assessment. We also discussed the problems of DNA barcoding and gave a prospect for its application in biodiversity.

DNA barcoding; biodiversity; taxonomy; species identification

2016-05-12 接受日期：2016-08-05

江蘇省自然科學基金項目(BK20131087)； 中央級公益性科研院所基本科研業務費專項項目(2013)； 江蘇省大學生實踐創新訓練計劃項目(201514436007Z)

陳煉(1982—)， 女， 博士， 副研究員， 主要從事分子生態學研究， E-mail：chenlian_2004@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：xhg@nies.org

10.11984/j.issn.1000-7083.20160123

Q523

A

1000-7083(2016)06-0942-08