軟棗獼猴桃雌雄株葉片中多胺含量的高效液相色譜檢測

徐聆粵，姜 丹，郭夢玉，黃圓博，樸一龍

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133000)

?

軟棗獼猴桃雌雄株葉片中多胺含量的高效液相色譜檢測

徐聆粵，姜 丹，郭夢玉，黃圓博，樸一龍*

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133000)

植物體內源多胺含量與植物性別有關，為了鑒定軟棗獼猴桃雌雄株性別，本試驗采用高效液相色譜法對始花期軟棗獼猴桃雌雄株葉片測定了腐胺、亞精胺和精胺的含量。結果表明：檢測條件以苯甲酰化反應溫度37 ℃，25 min，色譜柱為 C18(150 mm×4.6 mm 3 μ)柱，柱溫40 ℃，流動相A為甲醇，B為水，體積比為64∶36，流動相的流速0.6 mL/min，檢測波長230 nm為最佳。軟棗獼猴桃始花期雄雌株中，雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株，雌雄株葉片中亞精胺含量無顯著差異。

軟棗獼猴桃；雌雄株；高效液相色譜法；多胺；苯甲酰化

軟棗獼猴桃是一種光果獼猴桃種類之一，被譽為“世界之珍果”[1]，是獼猴桃屬中在我國地域分布最廣泛的野生果樹之一[2]。目前軟棗獼猴桃在世界各地被稱為第3代獼猴桃，與我們所熟知的中華獼猴桃、美味獼猴桃相比更具有保健價值。其植株為雌雄異株植物，不同性別的植株中各種內源物質的含量及對環境的適應能力也有差異。

多胺是高等植物體內不可缺少的生理活性物質，其種類主要有腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)，它們不僅參與了植物各種生長發育過程[3]，還與抗逆性密切相關[4]。研究表明，多胺在一定濃度范圍內有促進植物生長與分化、延緩許多雙子葉和單子葉植物離體葉片衰老的作用[5-6]。多胺還與植物的性別分化有關，對植物雌雄蕊的發育具有調節作用。大量研究表明,外源噴施腐胺、亞精胺與精胺能夠增加植物花芽的數目,特別是在內源水平低的情況下,促進花芽形成的效果更加明顯[7-8]。陳坤明等則認為，亞精胺和精胺的累積是增強作物抗旱性的主要因素[9]。

多胺在人體內也起到至關重要的作用。多胺主要存在于植物體內，人類可以通過食物攝取多胺，人體內少量的多胺可以通過自身代謝排出體外，但攝入量過多時會對身體造成傷害。因此，如何高效快速地檢測植物中的多胺含量成為了人們越來越關注的內容。檢測多胺常采用化學發光法、電化學檢測法、薄層色譜法等，但是這些方法都存在實驗結果不準確、檢測效率低等問題。經過長期研究和技術更新，現在多采用高效液相色譜法或反高效液相色譜法檢測，效率高、結果精準。劉俊等[10]研究了高效液相色譜法檢測組織中多胺含量的方法，但利用該方法檢測多胺含量也存在如何正確選擇色譜條件、異常峰的處理等多方面問題。劉華英等[11]探討了苯甲酰化反應的最佳條件和色譜條件。在研究雌雄異株植物中多胺含量的差異時，不同植物種類的檢測結果不同，而且還存在一些爭議，對于軟棗獼猴桃雌雄株中多胺含量的檢測也少有相關研究。

本試驗僅以始花期的軟棗獼猴桃雌雄株葉片為材料，采用高效液相色譜法測定其葉片中腐胺、亞精胺、精胺的含量并進行比較，為今后軟棗獼猴桃多胺含量測定及雌雄株的鑒別提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

材料于2014年6月3日取自延邊大學農學院軟棗獼猴桃資源圃，選取8年生樹勢中庸、無病蟲害、無機械損傷的軟棗獼猴桃雌雄株各5株，摘取其雌雄株葉片若干，裝入冰盒運回實驗室，液態氮研磨后置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

高效液相色譜儀(日本島津公司的LC-2010A HT)，色譜柱(Adsorbosphere HS C18150 mm×4.6 mm 3 μ)，超聲波清洗器，渦旋儀，水浴鍋，離心機(Himac CR22G)，氮吹儀，電子天平，恒溫干燥箱，針筒式濾膜(0.45 μm，有機系)。

1.2.2 試劑

腐胺(put)、亞精胺(spm)、精胺(spd)3種標準品均為sigma公司產品，甲醇為色譜純，其余試劑均為國產分析純，實驗用水為雙蒸水。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和測定

材料處理方法參考Flores H E等[12]的方法并稍作改動。選取軟棗獼猴桃雌雄株葉片各1.60 g，用液態氮充分研磨至粉末，加入2 mL預冷的5%高氯酸溶液繼續研磨后，轉入14 mL離心管中，再用2 mL的5%高氯酸溶液沖洗研缽并轉入離心管中渦旋混勻，冰浴浸提1 h，再以10 000 r/min、4 ℃的條件下離心40 min，取500 μL上清液，加入1 mL 2 M的NaOH和7 μL的苯甲酰氯渦旋20 s充分混合均勻，37 ℃水浴反應25 min完成后，加入2 mL飽和NaCl渦旋混勻、再加入2 mL乙醚，以5 000 r/min離心5 min，收集1 mL上層醚相，用氮吹儀吹干，再次加入1 mL乙醚吹干，用500 μL甲醇溶解后，過0.45 μm濾膜，取10 μL進樣。

1.3.2 標準曲線的制作

混標配制參考趙雪萍等[13-14]的方法，并略加改進。準確稱取腐胺、亞精胺、精胺0.004 5、0.005 4和0.006 8 g，用預冷的5%高氯酸溶液溶解定容至10 mL容量瓶中，放進超聲波清洗器中3 min后，準確移取以上3種多胺標準溶液各100 μL混合均勻制成混合母液，再取100 μL母液進行苯甲酰化反應，步驟同上。分別取苯甲酰化后的多胺標準液依次稀釋1倍、5倍、12.5倍、25倍和50倍配制成混合標準系列，取10 μL進樣，用液相色譜儀分析測定，以峰面積對濃度分別繪制腐胺、亞精胺、精胺的工作曲線。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為 C18(150 mm×4.6 mm 3μ) 柱，柱溫40 ℃，檢測波長230 nm。以甲醇和水作為流動相，體積比設定為V甲醇∶V水= 64∶36，流速為0.6、0.7和0.8 mL/min。

1.3.4 數據分析

樣品重復3次，取平均值，試驗數據用SPSS19.0軟件進行統計分析，數值以平均數±標準誤差表示，采用獨立樣本T檢驗作顯著性差異分析，顯著水平為0.05、0.01。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

在波長230 nm、甲醇濃度64%條件下，不同流速對3種多胺分離的影響結果如表1。流速V=0.6 mL/min時，3種多胺峰面積表現出明顯優勢，各胺峰面積均大于流速V=0.7 mL/min和V=0.8 mL/min時各峰面積值，通常用分離度R=1.5作為兩峰完全分離的標志，而流速V=0.7、0.8 mL/min時，分離度過小，保留時間過于相近，3種多胺不能較好地分離。綜合考慮，以流速V=0.6 mL/min作為分離條件效果較好。3種多胺的檢測可以得到滿意的基線分離(圖1)，樣品也可在15 min內完成檢測。

表1 不同流速對多胺檢測的影響

圖1 多胺標準品的HPLC色譜圖

2.2 軟棗獼猴桃雌雄株葉片中多胺的測定

2.2.1 軟棗獼猴桃雌株葉片中多胺的測定

由圖2可知，軟棗獼猴桃雌株葉片中的亞精胺出峰面積顯著高于其他2種多胺，精胺出峰面積小于亞精胺但大于腐胺，腐胺峰面積相對最少。腐胺、亞精胺、精胺的出峰時間分別為4.55、5.91和12.47 min。

圖2 軟棗獼猴桃雌株葉片中多胺的液相色譜圖

2.2.2 軟棗獼猴桃雄株葉片中多胺的測定

由圖3可知，在軟棗獼猴桃雄株始花期葉片中3種多胺的峰面積差異顯著，腐胺出峰面積最高，顯著高于亞精胺和精胺，精胺出峰面積相對最小。腐胺和亞精胺、精胺的出峰時間分別為4.55、5.90和2.47 min。

圖3 軟棗獼猴桃雄株葉片中多胺的液相色譜圖

2.3 軟棗獼猴桃雌雄株葉片中多胺含量差異

由表2可知，在軟棗獼猴桃雌雄株始花期階段，雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株(P<0.05)，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株(P<0.01)，雌雄株葉片中亞精胺含量無顯著差異。因此，在始花期軟棗獼猴桃雌雄株葉片中腐胺、精胺含量可作為雌雄株差異的鑒別指標。

表2 軟棗獼猴桃雌雄株葉片多胺含量比較

注:*和**分別表示在P<0.05和P<0.01 水平上顯著性分析。

2.4 標準曲線的繪制

由于軟棗獼猴桃葉片中多胺的含量很低，在試驗中選擇較低濃度的多胺進樣，3種多胺的工作曲線見圖4。

腐胺、亞精胺、精胺的相關系數R2分別為為0.998 2，0.999 8和0.999 7。腐胺、亞精胺最低檢測限為0.3 μg/mL，精胺最低檢測限為0.4 μg/mL。腐胺、亞精胺、精胺3種多胺分別在0.3～7.5、0.4～11.3和0.3～9 μg/mL時，標準曲線呈良好線性關系。

圖4 3種多胺標準品的工作曲線

3 討論與結論

植物性別和體內多胺水平存在某種關系[15]。而且不同種類多胺在不同的植物種類或同一植物不同的器官中含量是不同的[16]。多胺的含量變化在不同育性的植物中存在一定差異，說明多胺與雄性不育的發生存在著一定關系。在菜豆雌蕊中腐胺、亞精胺、精胺的水平分別比雄蕊高出5倍、6倍和25倍。該試驗中，在軟棗獼猴桃始花期，雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株，雌雄株葉片中亞精胺含量無顯著差異。說明腐胺含量的變化可能與雄花的分化有關，精胺含量的變化可能與雌花的發生與發育有一定的相關性。汪俏梅等[17]在苦瓜(MomordicacharantiaL.)性別分化研究中也發現類似結果。研究結果表明，栝樓植株在始花期階段，其內源植物多胺的含量不同，雄株腐胺和精胺含量顯著高于雌株，雌株亞精胺含量顯著高于雄株[18]。但Rita等[19]研究結果表明，獼猴桃(Actinidiadeliciosa)雌雄花藥中多胺含量存在著差異，雄性不育的花藥中多胺的含量高于可育的花藥，尤其是植物接近開花時差異更大。Biasi等[20]研究獼猴桃生殖器官發育與多胺的關系表明，雌花比雄花含有更高的游離態多胺。多胺對高等植物性別分化的調控作用日益引起人們的重視，但研究結果還有分歧、或存在尚未開展的問題，還需要繼續深入研究。

1) 在甲醇濃度為64%的條件下以流速V=0.6 mL/min作為分離條件效果較好。3種多胺的檢測可以得到滿意的基線分離，樣品也可在15 min內完成檢測。

2) 雌株的腐胺、亞精胺、精胺含量分別為81.56、128.58和60.88 nmol/g。雄株的腐胺、亞精胺、精胺含量分別為362.97、153.03和30.59 nmol/g。

3) 軟棗獼猴桃始花期雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株，雌雄株葉片中亞精胺含量無顯著差異。

[1] 馮健，曾凡順，王嘉，等.軟棗獼猴桃良種選育研究進展[J].安徽農業科學，2015，43(11):46-47,87.

[2] 曾照旭，樸一龍，張先，等.CaCl2處理對軟棗獼猴桃果實軟化的影響[J].安徽農業科學，2014，42(03):925-928.

[3] 趙福庚，王曉云，王漢忠，等.花生葉片生長發育過程中多胺代謝的變化[J].作物學報，1999，25(02):249-253.

[4] Hu B Y，Niu M G，Wang Q M，et al.Relationship Between osmotic stress and polyamine levels in leaves of soybean seedlings[J].Plant Nutr Fer Sci，2006，12(06):881-886.

[5] 胡景江，左仲武.外源多胺對油松幼苗生長及抗旱性的影響[J].西北林學院學報，2004，19(04):5-8.

[6] 楊洪強，黃天棟，束懷瑞，等.外源IBA和PAs對蘋果幼苗新根形成、多胺及核酸含量的影響[J].園藝學報，1995，22(02):123-126.

[7] 徐繼忠，陳海江，李曉東，等.外源多胺對核桃花芽分化及葉片內源多胺含量的影響[J].園藝學報，2004，34(04):437-440.

[8] 徐繼忠，陳海江，邵建柱，等.外源多胺促進紅富士蘋果花芽形成的效應[J].果樹科學，1998，15(01):10-12.

[9] 唐明，王文麗，周瑩，等.豆梨和杜梨砧木根系中多胺代謝與高溫脅迫的關系研究[J].安徽農業科學，2013，41(06):2423-2425.

[10] 劉俊，吉曉佳，劉友良.檢測植物組織中多胺含量的高效液相色譜法[J].植物生理學通訊，2002，38(06):596-598.

[11] 劉華英，蕭浪濤，魯旭東，等.反相高效液相色譜法測定柑橘愈傷組織多胺[J].湖南農業大學學報(自然科學版)，2005，31(01):39-41.

[12] Flores H E，Galston A W.Analysis of polyamines in higher plants by high performance liquid chromatography[J].Plant Physiol，1982，69(03):701-706.

[13] 曉明，李俊彬，李永欣.金銀花多胺高效液相色譜法測定體系的建立[J].林業科技開發，2007，21(06):64-66.

[14] 趙雪萍.高效液相色譜法檢測大豆及豆制品中的多胺含量[D].青島:青島科技大學，2012.

[15] Kakkar R K，Rai V K.Plant polyamines in flowering and fruit ripening[J].Phytochem，1993，33(06):1281-1288.

[16] 李六林，張紹鈴.多胺在植物花發育中的作用[J].西北植物學報，2006，26(06):1282-1289.

[17] 汪俏梅，曾廣文.激素和多胺對苦瓜性別分化的影響[J].園藝學報，1997，24(01):48-52.

[18] 劉蕓，鐘章成，王小雪，等.栝樓雌雄植株激素和多胺含量的比較[J].園藝學報，2010，37(10):1645-1650.

[19] Rita B，Giuseppina F，Anna S，et al.Biochemical and ultrastructural features related to male sterility in the dioecious species Actinidia deliciosa[J].Plant Physiol Biochem，2001，39:395-406.

[20] Biasi R，Falasca G，Altamura M M，et al.Reproductive morphogenesis in kiwifruit in relation to polyamines[J].Acta Horticulturae，1997，44:479-48.

Determination of polyamine content in leaves of the male and female plants of Actinidia arguta by HPLC

XU Lingyue，JIANG Dan，GUO Mengyu，HUANG Yuanbo，PIAO Yilong*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

Endogenous polyamine content is related with sex development of plants. In order to identify male and female plants, contents polyamines including putrescine, spermidine polyamine and spermine in male and female plant leaves ofActinidiaargutaat the early flowering stage were determined by HPLC method. The results showed that the optimum determination condition was 37 ℃ for 25 min, chromatographic column C18 (150 mm × 4.6 mm 3μ) with column temperature 40 ℃ maintained, the mobile phase with the ratio of 64% methanol and 36% water, the flow velocity 0.6 mL/min and the detection wavelength 230 nm. At the early flowering stage ofActinidiaarguta, the putrescine content in female plant leaves was significantly higher than that in male plant leaves, the spermine content of male plant leaves was significantly higher than that in female plant leaves, whereas spermidine contents in male and female plant leaves were not significantly different.

Actinidiaarguta；male and female plants ；HPLC; polyamines；benzoylating

2016-05-12 基金項目：國家自然科學基金(31160068)

徐聆粵(1992—)，女，吉林長春人，在讀碩士,研究方向為果樹栽培生理。樸一龍為通信作者，

E-mail：piaoly@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)03-0220-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.007

S663.4

A