一株雞源H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定

陳翠騰 傅光華 萬春和 陳 珍 朱春華 劉榮昌 傅秋玲 程龍飛 陳紅梅 施少華 黃 瑜

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所福建省禽病防治重點實驗室福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州350013）

一株雞源H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定

陳翠騰 傅光華 萬春和 陳 珍 朱春華 劉榮昌 傅秋玲 程龍飛 陳紅梅 施少華 黃 瑜*

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所福建省禽病防治重點實驗室福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州350013）

從福州市某活禽市場采集的雞泄殖腔棉拭子樣品中分離出1株病毒，經(jīng)血凝抑制試驗（HI）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法鑒定為H9N2亞型禽流感病毒。在GenBank基因庫中對該病毒株的3個基因片段的測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析表明，3個基因片段均屬于H9N2亞型禽流感病毒的基因。HA基因遺傳進(jìn)化分析表明，該病毒分離株與代表株DK/HK/Y280/97處于同一分支，與上海的雞源分離株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高，同源性為99.5%。

H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定

禽流感（AI）是由正黏病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒引起的禽類感染。根據(jù)禽流感病毒對易感禽的致病性將其分為高致病性（HPAI）、低致病性（LPAI）和無致病性3種。H9N2亞型AIV，屬于低致病性禽流感病毒，是家禽中最常見的病毒之一。H9N2亞型AIV最早于1966年從火雞體內(nèi)分離到[1]。陳伯倫等[2]于1994年報道從發(fā)病蛋雞體上分離到H9N2亞型AIV。此后，H9N2亞型AIV在我國廣泛存在，且多呈低致病性感染，并呈逐漸蔓延之勢[3]。H9N2亞型AIV流行范圍廣、可造成宿主免疫力低下并誘發(fā)其他致病性微生物的協(xié)同作用，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害。

本研究從福州市某活禽市場采集的泄殖腔棉拭子樣品中分離出1株雞源禽流感病毒，經(jīng)血清學(xué)分析和分子生物學(xué)檢測，確定該AIV分離株為H9N2亞型AIV。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料9～10日齡SPF雞胚購自福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司；病料采自福州市某活禽市場。

1.1.2 儀器和試劑凝膠成像分析系統(tǒng)為?BIORAD公司產(chǎn)品；PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；TIANamp Virus RNA Kit病?毒RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans5α

Chemically Competent Cell均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T Vector、DNA Marker均購自TaKaRa公司；AIV型特異性血清、抗禽流感病毒HA亞型(H5、H7、H9亞型)血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，ND、EDS-76陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 引物參照GenBank數(shù)據(jù)庫上已發(fā)布的禽流感病毒M基因序列，運用Oligo 7軟件設(shè)計A型禽流感病毒檢測引物，參照已發(fā)布的HA和NA基因序列，設(shè)計H9亞型和N2亞型基因特異性引物，引物的具體信息見表1，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物信息

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理用無菌棉拭子采集雞群泄殖腔內(nèi)容物，浸泡于1 mL含青霉素（2 000 IU/mL）和鏈霉素（2 000 IU/mL）的無菌PBS緩沖液（pH7.4）中，充分振蕩混勻后，于8 000 r/min離心15 min，取上清經(jīng)0.22 μm濾器抽濾后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原的分離培養(yǎng)將處理好的樣品經(jīng)尿囊腔接種2枚10日齡SPF雞胚，每枚0.3 mL，37℃孵育，每日觀察3次，無菌收集48～72 h的胚液，無菌檢驗后繼續(xù)傳3代，無菌回收尿囊液，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒的血凝活性測定及血凝抑制試驗按照文獻(xiàn)[4]的方法對病毒分離株進(jìn)行血凝（HA）試驗，然后以4個血凝單位的病毒液分別與抗NDV、EDSV-76及H5、H7、H9亞型禽流感病毒等標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行微量血凝抑制試驗（HI）。

1.2.4 病毒PCR鑒定

1.2.4.1 病毒核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄將病毒尿囊液按照TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取試劑盒操作說明提取病毒核酸，再用TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.4.2 目的基因的PCR擴(kuò)增以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×Easy-Taq?PCR SuperMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板3 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，10℃保溫。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4.3 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析將擴(kuò)增的目的片段連接到pMD18-T載體，克隆到Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆菌送上海生工生物工程技術(shù)公司測序。測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析，并用Lasergene軟件包和MEGA6軟件進(jìn)行基因序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離及血凝活性測定病毒分離株接種SPF雞胚傳代后，72 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，回收的胚液按常規(guī)方法測定血凝活性，結(jié)果表明可凝集1%雞紅細(xì)胞，血凝效價為25。

2.2 病毒血凝抑制試驗按常規(guī)方法對SPF雞胚尿囊液進(jìn)行血凝抑制試驗，結(jié)果表明含毒尿囊液僅被抗禽流感病毒H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清特異性抑制，而不被抗EDSV-76、NDV和H5、H7亞型禽流感病毒等標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制。

2.3 病毒的RT-PCR鑒定用禽流感病毒A型特異性引物、H9亞型HA和N2亞型NA基因特異性引物擴(kuò)增該分離株的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明，擴(kuò)增產(chǎn)物均與預(yù)期結(jié)果相符（見圖1）。

2.4 目的基因測序結(jié)果及進(jìn)化分析在GenBank基因庫中對病毒株（A/chicken/Fujian/05/2015）的3個基因目的片段的測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析，3個基因均屬于H9N2亞型禽流感病毒的基因，該結(jié)果與血清學(xué)試驗結(jié)果相符。HA基因遺傳進(jìn)化分析表明，該病毒分離株與代表株DK/HK/Y280/97

處于同一分支，與上海的雞源分離株A/chicken/ Shanghai/06/2015（H9N2）同源性最高，同源性為99.5%；與常用疫苗株CK/SH/F/98、CK/SD/6/96、CK/ GD/SS/94的同源性依次為87.4%、87.9%、88.2%（見圖2-圖3）。

3 討論

目前，H9N2亞型禽流感病毒已在家禽中建立了穩(wěn)定的種系，廣泛分布在世界各地[5-6]，雖然H9N2亞型AIV對養(yǎng)殖業(yè)的影響一般不表現(xiàn)為感染家禽導(dǎo)致大批死亡，該病毒感染家禽后，僅引起輕微的臨床癥狀，有的則無臨診表現(xiàn)，但該型病毒感染容易引起繼發(fā)感染并降低生產(chǎn)能力，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。尤其是對近年來新發(fā)感染人的H7N9亞型AIV的研究發(fā)現(xiàn)，其6個內(nèi)部基因均含有H9N2亞型AIV的6個內(nèi)部基因的重組痕跡[9]，提示我們在關(guān)注H5N1亞型高致病性禽流感病毒的同時，還應(yīng)該加強(qiáng)對H9N2亞型低致病性禽流感病毒的研究和防控。

本研究分離的1株雞源禽流感病毒，經(jīng)血清學(xué)分析和分子生物學(xué)檢測，確定該AIV分離株為H9N2亞型AIV。該病毒與中國近期流行于家禽中的H9N2亞型禽流感病毒的同源性較高，所擴(kuò)增的3個片段均為禽源H9N2流感病毒的相應(yīng)基因片段。Guan等[10]將歐亞種系H9N2亞型AIV的HA基因分為3個群系，其代表毒株分別為A/quail/Hong Kong/G1/97、A/Duck/Hong Kong/Y280/97和A/Duck/ Hong Kong/Y439/97；本研究分離的病毒株HA基因遺傳進(jìn)化分析表明，該AIV分離株與代表株A/ Duck/Hong Kong/Y280/97處于同一分支，與常用疫苗株的同源性較高。以上結(jié)果表明，流行于雞群中的H9N2亞型流感病毒仍然處于一個較穩(wěn)定的遺傳演化過程。

[1]Hommee P,Easterday B.Characteristics of A-Turkey-Wisconsin-1966 virus[J].Avian Dis,1970,14(1)：66-74.

[2]陳伯倫,張澤紀(jì),陳偉斌.禽流感研究I.雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,1994,20(10)：3-5.

[3]Sun Y,Liu J.H9N2 influenza virus in China：a cause ofconcern[J].Protein Cell,2015,6(1)：18-25.

[4]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社,1997：736-767.

[5]Liu J H,Okazaki K,Mweene A,et al.Genetic conservation of hemagglutinin gene of H9 influenza virus in chicken population in Mainland China[J].Virus Genes,2004,29(3)：329-334.

[6]Guo Y J,Krauss S,Senne D A,et al.Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia[J].Virology,2000,267：279-288.

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[9]Liu D,Shi W,Shi Y,et al.Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：phylogenetic,structural,and coalescent analyses[J].Lancet,2013,381 (9881)：1926-1932.

[10]Guan Y,Shortridge K F,Krauss S,et al.Two lineages of H9N2 influenza virus continue to circulate inland-based poultry in southeastern China[J].Intemational Congress Series,200l,1219：187-193.

Isolation and identification of a H9N2 subtype avian influenza virus strain from chicken

Chen Cuiteng Fu Guanghua Wan Chunhe Chen Zhen Zhu Chunhua Liu Rongchang

Fu Qiuling Cheng Longfei Chen Hongmei Shi Shaohua Huang Yu*
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Science,Fujian Key Laboratory of Poultry Disease Prevention and Control,Fujian Animal Disease Control Technology Development Center,Fuzhou 350013）

A strain of H9N2 subtype avian influenza virus was isolated from the chicken cloacal swab samples collected from a live poultry market in Fuzhou city.The virus was identified by hemagglutination-inhibition test(HI)and]polymerase chain reaction(PCR). Analyzed by BLAST in Gen Bank database,the three genes fragment were all derived from the genes pool of H9N2 subtype avian influenza viruses.The phylogenetic analysis of HA gene showed that the fragment of the isolated virus was similar to that of the representative strain DK/HK/Y280/97 lineage of H9N2 viruses and share 99.5%similarity with the strain A/chicken/Shanghai/06/2015 (H9N2)isolated from chicken in Shanghai.

H9N2 subtype avian influenza virus Isolation Identification

A

1003-4331（2016）06-0023-04

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才創(chuàng)新基金（2014CX-4）、公益類科研院所專項（2015R1023-9）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項資金（CARS-43）、新世紀(jì)“百千萬人才工程”國家級人選科研補(bǔ)助基金（NCNCMTPC-2009）、福建省優(yōu)良蛋鴨品種與設(shè)施化養(yǎng)殖創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)化工程項目（2014-2016）、福建省畜禽疫病防控技術(shù)重大研發(fā)平臺（2014N2003）資助。

陳翠騰（1987-），女，碩士，研究實習(xí)員。研究方向：動物病原與分子生物學(xué)，E-mail：chencuiteng@163. com。

*通信作者：黃瑜（1965-），男，博士，研究員。研究方向：家禽傳染病學(xué)，E-mail：huangyu_815@163.com。