I型大麻素受體介導大麻素　HU210對星型膠質細胞　CXCR4水平下調

朱舟，韓靜，張遐，徐逸

（1華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經科，武漢 430030；2陜西師范大學現代教學技術教育部重點實驗室，西安 710061；3加拿大渥太華大學 IMHR，渥太華 K1Z7H3；4華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院整形外科，武漢 430030）

I型大麻素受體介導大麻素HU210對星型膠質細胞CXCR4水平下調

朱舟1，韓靜2，張遐3，徐逸4*

（1華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經科，武漢 430030；2陜西師范大學現代教學技術教育部重點實驗室，西安 710061；3加拿大渥太華大學 IMHR，渥太華 K1Z7H3；4華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院整形外科，武漢 430030）

目的 探尋大麻素抑制中樞神經系統免疫反應的機制，為大麻素臨床藥物的合理應用提供實驗依據。方法用不同濃度的HU210刺激培養的星形膠質細胞，利用Western blot檢測并比較刺激組和未刺激組細胞CXCR4蛋白水平的差異，進而用I型大麻素受體（type-1 cannabinoid receptor，CB1R）拮抗劑AM281刺激細胞后，觀察HU210對CXCR4表達的影響。結果 Western blot檢測結果顯示，高濃度HU210能下調星形膠質細胞CXCR4表達，AM28能阻斷HU210所致的CXCR4下調。結論 HU210經由CB1R下調CXCR4，這可能是大麻發揮免疫抑制作用的機理之一。

大麻素；1型大麻素受體；CXCR4；星形膠質細胞

基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）是趨化因子 CXC亞家族的一員，其受體為CXCR4。在中樞神經系統 SDF-1／CXCR4對神經元及神經膠質細胞的遷移／分化和生存起重要的作用［1，2］。膠質細胞的 CXCR4與中樞神經系統的炎性反應和神經毒性反應密切相關。在多發性硬化、Alzheimer病及腦腫瘤的病理過程中，星形膠質細胞、白細胞和血管內皮細胞的CXCR4表達明顯增高［3，4］。另外，作為HIV病毒的中樞神經系統受體之一［5，6］，CXCR4參與HIV導致的神經元死亡和癡呆［7，8］。因此，阻斷CXCR4受體，可能是潛在的神經保護途徑。

越來越多研究已經證實大麻素能抑制中樞神經系統炎性反應，緩解多發性硬化、腦卒中等疾病的進展［9-12］，但其機制尚不明確。為了揭示大麻素抑制免疫功能的機制，為大麻素臨床藥物的合理應用提供實驗依據，我們利用人工合成大麻素HU210和I型大麻素受體（type-1 cannabinoid receptor，CB1R）拮抗劑AM281，觀察HU210對星形膠質細胞（astrocyte，AS）內CXCR4水平的影響及其機制。

材料與方法

1 動物

實驗動物為出生0～2天的Sprague-Dawley（SD）大鼠，由Charles River Laboratories（美國實驗動物公司加拿大渥太華分部）提供。動物飼養條件和實驗程序嚴格按加拿大國家實驗動物委員會動物使用和管理條例執行。

2 主要試劑

HU210購于Tocris，AM281購于Sigma，小鼠抗GFAP單克隆抗體、多克隆兔抗CB1R購于Chemicon，多克隆兔抗CXCR4購于Abcam，多克隆兔抗βactin購于Santa Cruz，辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG購于Sigma，Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 568羊抗兔IgG購于Molecular Probes，ECL顯色試劑盒及蛋白測試BCA試劑盒購于Pierce。

3 星形膠質細胞培養和鑒定

取0～2d的SD大鼠幼崽大腦皮層，吹打分散成106／ml細胞懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的培養瓶中，置于37°C、5%CO2培養箱，第2d更換培養基，以后每3d換1次培養基，培養第6d將培養瓶置于37°C恒溫搖床150r／min振搖2h，棄培養基后用0.125%的胰酶消化貼壁細胞，吹打成細胞懸液后以種植密度106個／cm2接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片的6孔板。對AS進行AS特異性蛋白GFAP熒光標記和DAPI染核，計算AS的培養純度。AS培養純度達99.05%±2.20%。

4 實驗分組

將生長融合的星形膠質細胞培養基中加入不同濃度HU210，HU210由DMSO溶解，分為對照組（僅加入DMSO）、3μmol／L組、6μmol／L組和12μmol／L組。

5 免疫熒光染色

取出培養皿中蓋玻片，0.01mol／L PBS沖洗3次后，用100%甲醇固定30min，10%牛血清白蛋白封閉30min后，在不同的玻片上分別加入一抗小鼠抗GFAP單克隆抗體（1∶500）／兔抗CB1R抗體（1∶300）和一抗小鼠抗GFAP單克隆抗體（1∶500）／兔抗CXCR4（1∶300），4℃孵育過夜后，PBS充分洗去一抗，加入Alexa Fluor 488羊抗小鼠（1∶500）和Alexa Fluor 568羊抗兔（1∶500），PBS充分漂洗后在熒光顯微鏡（Zeiss LSM510 META）下觀察、拍照；陰性對照用PBS替代一抗。

6 Western blot檢測

分別用不同濃度HU210和50μmol／L AM281刺激生長融合的星形膠質細胞5h后，去除細胞培養基，用D-Hanks清洗兩遍，按說明書用M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent試劑盒對細胞進行裂解，5min后收集細胞裂解液，離心14，000g（4°C）20min，收集上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度；加40μg蛋白樣到12%SDS-PAGE中進行垂直電泳分離，然后全濕式電轉法轉至 PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2h，兔抗CXCR4（1∶500）、兔抗CB1R（1∶500）及兔抗β-actin（1∶500）。4°C慢搖過夜，次日充分漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG（1∶2，500），在室溫下搖動孵育2h，ECL試劑盒顯色，用數字照相成像系統（Alpha Innotech）拍照并進行條帶分析（AlphaEase FC software），以測定目的蛋白水平。

7 統計學分析

結 果

1 高濃度HU210下調星形膠質細胞內CXCR4

為了明確培養的AS是否表達CXCR4及CB1R，對分離培養的AS進行GFAP／CXCR4和GFAP／CB1R免疫熒光雙標檢測。結果顯示，AS特異性標記蛋白GFAP在胞質表達，CXCR4和CB1在胞質和細胞膜均有表達（圖1）。

用不同濃度HU210刺激AS 5h后收集細胞，提取蛋白，進行 Western blot檢測，結果顯示，與用溶媒（vehicle）DMSO刺激的對照組細胞相比，3μmol／L HU210刺激AS對CXCR4水平無明顯明顯影響，6μmol／LHU210刺激后CXCR4的水平顯著降低，12μmol／L HU210刺激后CXCR4水平 6μmol／LHU210刺激后相似，即高濃度HU210下調AS內CXCR4水平的影響并非劑量依賴性（圖2）。

圖1　培養星形膠質細胞中GFAP、CXCR4和CB1R表達的免疫熒光染色。比例尺，50 μmFig.1　Immunofluorescent staining for detection of the expression of GFAP，CXCR4 and CB1R in the cultured astrocytes.Scale bar，50μm

圖2　HU210對培養星形膠質細胞內CXCR4水平的影響。A，HU210刺激　AS后，CXCR4水平的　western blot檢測；B，HU210刺激　AS后，CXCR4水平變化的統計學分析；**，與溶媒刺激細胞相比，P＜0.01；n＝4Fig.2　The effect of HU210 on CXCR4 level in the cultured astrocytes.A，Western blot detection of CXCR4 level in the cultured astrocytes after HU210 treatment；B，statistical analysis of the change in CXCR4 level in the cultured astrocytes after HU210 treatment；**，P＜0.01 versus astrocytes treated with the vehicle；n＝4

2 CB1R拮抗劑阻斷HU210對星形膠質細胞內CXCR4的下調作用

為了明確CB1R是否參與HU210對CXCR水平的下調作用，繼而檢測了CB1R的選擇性拮抗劑AM281對HU210下調星形膠質細胞內 CXCR4水平作用的影響。將AS分為對照組、HU210組及HU210＋AM281組，各自分別以DMSO、6μmol／L HU210以及6μmol／L HU210聯合50 μmol AM281，對AS進行孵育5h后進行Western blot檢測。結果表明，AM281能阻斷HU210導致的CXCR4蛋白水平下降，提示HU210作用于CB1R而降低CXCR4的蛋白水平（圖3）。

圖3　AM281阻斷 HU210對培養星形膠質細胞內CXCR4水平的下調作用。A，HU210和 AM281對培養星形膠質細胞內　CXCR4水平影響的Western blot檢測；B，HU210和AM281對培養星形膠質細胞內CXCR4水平影響的統計學分析；**，與溶媒刺激細胞相比，P＜0.01；n＝4Fig.3　AM281 blocked the down-regulation of CXCR4 by HU210 in the cultured astrocytes.A，Western blot detection of the effect of HU210 and AM281 on CXCR4 level in the cultured astrocytes；B，statistical analysis of the effect of HU210 and AM281 on CXCR4 level in the cultured astrocytes；**，P＜0.01 versus astrocytes treated with the vehicle；n＝4

討 論

在正常中樞神經系統中，神經元、神經膠質細胞和血管內皮細胞可持續低水平表達SDF-1和其受體CXCR4。SDF-1／CXCR4對細胞定向趨化發揮重要作用，研究表明多種中樞神經系統疾病，如實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型及多種腦部原發腫瘤均存在病變部位CXCR4的表達上調［12］。研究認為CXCR4的上調與神經系統損傷及神經元死亡相關，在新生小鼠腦組織缺血缺氧模型中，利用地塞米松干預能下調CXCR4的表達，影響炎癥級聯反應，從而發揮神經保護作用［13］。星形膠質細胞參與CXCR4相關的神經元死亡，中樞神經系統損傷局部SDF-1分泌增多，星形膠質細胞被升高的SDF-1趨化到損傷部位，聚集的星形膠質細胞產生大量炎性因子和神經毒性物質，比如TNF-α和谷氨酸，導致神經元損傷死亡［14］。因此阻斷星形膠質細胞CXCR4可能起到神經保護作用。

桑科植物大麻是最早被人類認識的成癮性植物之一，因其具有特殊的藥理學作用，日益受到研究者的廣泛重視。目前，大麻素免疫抑制及抗炎功效已被認為對多種神經系統疾病，如缺血性腦卒中、多發性硬化、帕金森病、阿爾茨海默病等有治療效果［9-12］。大麻的抗炎效應及免疫抑制機制尚不明確，可能與大麻素抑制突觸前谷氨酸釋放減輕神經毒性反應，并能抑制TNF-α、NO和IL-1等細胞因子的生成。

對體外培養AS的研究表明，低濃度（3μmol／L）HU210對CXCR4水平無顯著影響，但高濃度（6μmol／L和12μmol／L）HU210干預5h后可以顯著降低CXCR4水平。人工合成大麻素 HU210的化學名為1，l-乙基庚基-1l-羥基四氫大麻酚，是大麻素的活性成分四氫大麻酚（△9tetrahydrocannabinol，△9THC）的結構類似物，通過作用于CB1R發揮作用，和△9THC比，與受體的親和力更強，作用持續時間更久。

目前，國內外關于大麻素與SDF-1／CXCR4相關性研究較少，為數不多的研究發現高濃度的大麻素WIN 55，212-2顯著抑制SDF-1導致的淋巴細胞趨化［15］；大麻素THC能抑制HIV感染所致的免疫反應，而CXCR4作為HIV進入宿主細胞的輔助受體之一，提示THC和CXCR4間可能存在相互作用［16］。我們的研究檢測了大麻素對CXCR4水平的影響，證實大麻素的確能通過CB1R下調星形膠質細胞CXCR4，可能是大麻發揮免疫抑制作用的機理之一。如前所述，中樞神經系統疾病存在廣泛CXCR4表達上調，CXCR4的上調與炎性反應及神經損傷密切相關，大麻素對CXCR4的下調作用則為大麻素在中樞神經系統疾病的臨床應用提供了理論基礎。

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Type-I cannabinoid receptor mediates down-regulation of CXCR4 in astrocytes by cannabinoid HU210

Zhu Zhou1,Han Jing2,Zhang Xia3,Xu Yi4*
（1Department of Neurology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China；2The Modern Teaching Technology Key Laboratory of the Ministry of Education，Shaanxi Normal University，Xi＇an 710061，China；3IMHR，University of Ottawa，Ottawa K1Z 7H3，Canada；4Plastic Surgery Department，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Objective This research aimed to explore the mechanism of cannabinoids in restraining immunoreaction in the central nervous system to seek the theoretical basis for clinical application.Methods The cultured astrocytes were stimulated with various concentrations of HU210；the expression levels of CXCR4 protein were detected by western blot,and compared between groups with and without cannabinoid treatment.The cells were then treated with AM 281,an antagonist of type-1 cannabinoid receptor(CB1R), and the change of CXCR4 expression was measured.Results Western blot results showed that high concentration HU210 could downregulate CXCR4 expression in astrocytes；however,CB1R antagonist AM281 was able to block this effect.Conclusion HU210 downregulates CXCR4 expression through CB1R,which might be one of the mechanisms for the immunosuppression effect of cannabinoids.

Cannabinoids；type-1 cannabinoid receptor；CXCR4；astrocyte

R931.71

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.002

2016-08-01

2016-10-08

華中科技大學自主創新研究基金（2015ZHYX011）；湖北省科技支撐計劃（2015BKA220）

朱舟，女（1978年），漢族，副教授

（To whom correspondence should be addressed）：stmartin2005＠foxmail.com