阿爾茨海默病樹鼩模型建立的探索

歐陽軼強(qiáng), 胡冰, 張瑩, 羅少仕, 梁錦寧, 李家富, 郭松超*

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，南寧530021； 2. 廣西醫(yī)科大學(xué)生物靶向診治研究中心，南寧530021)

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DOI:10.11984/j.issn.1000-7083.20150284

阿爾茨海默病樹鼩模型建立的探索

歐陽軼強(qiáng)1, 胡冰1, 張瑩2, 羅少仕1, 梁錦寧1, 李家富1, 郭松超1*

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，南寧530021； 2. 廣西醫(yī)科大學(xué)生物靶向診治研究中心，南寧530021)

目的 探索建立樹鼩阿爾茨海默病(AD)動(dòng)物模型的可行性。方法 將30只成年雄性樹鼩Tupaiabelangeri隨機(jī)分成3組，模型組腹腔注射D-半乳糖(D-gal)造成急性衰老后，對樹鼩雙側(cè)海馬內(nèi)一次性注射β淀粉樣蛋白1～42片段(Aβ1～42)和鵝膏蕈氨酸(IBO)的混合液，對照(生理鹽水)組將所有藥物替換為等劑量生理鹽水，空白組不做處理。用Morris水迷宮對3組樹鼩進(jìn)行行為學(xué)測試，用蘇木精-伊紅染色法和鍍銀染色法進(jìn)行病理檢測分析。結(jié)果 Morris水迷宮測試結(jié)果提示，模型樹鼩出現(xiàn)了明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。病理檢測結(jié)果顯示，模型組腦海馬區(qū)出現(xiàn)明顯膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)纖維纏結(jié)。對照組和空白組無明顯病理改變。結(jié)論 腹腔注射D-gal，雙側(cè)海馬注射Aβ1～42和IBO混合液的方法可以造成樹鼩學(xué)習(xí)記憶能力下降，并出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)纖維纏結(jié)，是一種可行的樹鼩AD模型造模方法。

樹鼩；阿爾茨海默?。粍?dòng)物模型

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種威脅人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前對于AD的治療還沒有十分明確的方法(Mohammadetal.，2012)。建立良好的AD動(dòng)物模型，有助于增加對AD病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，并可以指導(dǎo)AD的預(yù)防和治療。目前的AD模型按動(dòng)物種類劃分主要有靈長類動(dòng)物模型和嚙齒類動(dòng)物模型兩大類。靈長類動(dòng)物模型價(jià)格十分昂貴，嚙齒類動(dòng)物模型則與人類神經(jīng)系統(tǒng)差別較大。建立一種費(fèi)用相對低廉，但是比嚙齒類動(dòng)物更接近人類的動(dòng)物模型對于AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究很有意義。樹鼩Tupaiabelangeri的遺傳學(xué)研究表明其在生物學(xué)上比嚙齒類動(dòng)物更接近靈長類動(dòng)物(Lietal.，2012；許凌等，2013)，有著明顯大于大鼠的大腦和更高級的神經(jīng)系統(tǒng)，應(yīng)用樹鼩進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究有著良好的前景。與靈長類動(dòng)物相比，樹鼩又具有體型小、繁殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，值得我們進(jìn)行相關(guān)的探索。同時(shí)，樹鼩有著遠(yuǎn)低于靈長類動(dòng)物的價(jià)格，在實(shí)驗(yàn)操作上也更為簡便。開發(fā)樹鼩模型，有助于減少靈長類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)用量。目前尚無利用樹鼩成功制作AD模型的報(bào)道。國內(nèi)也有學(xué)者利用樹鼩進(jìn)行AD的相關(guān)研究(何保麗等，2013)，但該研究僅對腦內(nèi)注射β-淀粉蛋白(Aβ1～40)的樹鼩進(jìn)行了基因表達(dá)方面的探討，未對樹鼩進(jìn)行行為學(xué)、病理學(xué)檢測以判定模型是否成立。樹鼩的體型與大鼠相似，頭部外形也比較接近，可以利用大鼠腦立體定位儀進(jìn)行腦內(nèi)注射。大鼠的AD模型造模方法相對成熟，故我們參照目前常用的大鼠AD模型的造模方法和檢測指標(biāo)，嘗試用樹鼩制作AD模型，探索其可行性，為探索樹鼩神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性樹鼩30只，3月齡，體質(zhì)量120 g±10 g，昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)2013-0002。

1.2 主要試劑和儀器

β淀粉蛋白(Aβ1～42)，鵝膏蕈氨酸(ibotenic acid，IBO)，D半乳糖(D-gal)美國Sigma公司生產(chǎn)。Aβ1～42濃度為2 g·L-1，用滅菌生理鹽水配制，在37 ℃下孵育72 h，使其成為凝聚態(tài)的Aβ1～42。

腦立體定向儀:RWD68002,深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Morris水迷宮:廣西醫(yī)科大學(xué)研制；微量注射器:上海安亭微量進(jìn)樣器廠；電子天平:ML204，瑞士梅特勒-托利多公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

將30只樹鼩按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組：模型組，對照組和空白組，每組10只。模型組:參考關(guān)于大鼠復(fù)合AD造模方法的文獻(xiàn)進(jìn)行改良方法造模(劉學(xué)鳳等，2012)；對照組：操作與模型組相同，所有藥物改為生理鹽水，注射劑量和部位與模型組相同；空白組：不做任何處理。

2.2 動(dòng)物模型的建立

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(桂)2009-0004。

模型組樹鼩連續(xù)30 d腹腔注射D-gal 50 mg·(kg·d)-1，使其早衰。第31天用1%戊巴比妥鈉，2 mL每千克體質(zhì)量腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將樹鼩固定于大鼠腦立體定向儀上。沿頭頂部正中切開皮膚暴露矢狀縫，以矢狀縫同對耳線的交點(diǎn)作為起始原點(diǎn)，向前3.3 mm，左右兩側(cè)5 mm處鉆開顱骨，將微量注射器針頭通過立體定位儀經(jīng)開孔垂直刺入腦10 mm，緩慢勻速進(jìn)針時(shí)，用時(shí)5 min使針尖達(dá)到樹鼩海馬區(qū)(海馬區(qū)定位參照樹鼩腦立體定位圖譜)(楊文光，1990)，緩慢推入Aβ1～42和IBO混合液5 μL(Aβ1～42 10 μg和IBO 10 μg溶于生理鹽水)，15 min內(nèi)注射完畢，留針10 min后緩慢提出針頭，縫合，75%乙醇消毒。

腦內(nèi)注射后觀察樹鼩外觀、飲食、飲水、自主活動(dòng)情況，4周后進(jìn)行行為學(xué)指標(biāo)觀察。

2.3 行為學(xué)指標(biāo)檢測

采用經(jīng)典的Morris水迷宮觀察樹鼩的學(xué)習(xí)記憶能力。

Morris水迷宮系統(tǒng)主要由盛水的圓形水槽迷宮、隱藏在水面下的平臺(tái)、視頻分析系統(tǒng)(包括攝像機(jī)、數(shù)字圖像采集卡、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和分析軟件)組成。水槽直徑150 cm，深60 cm，攝像鏡頭安放于水槽中心上方3 m高度。按東南西北4個(gè)方向?qū)⑺燮骄鶆澐譃?個(gè)象限：東北、西北、東南、西南，將各象限水槽壁中點(diǎn)標(biāo)為入水點(diǎn)，入水點(diǎn)處貼上醒目標(biāo)記以區(qū)分不同象限。站臺(tái)半徑5 cm，高30 cm，純黑色塑料材質(zhì)，固定放置于任一象限的中央，水槽中水面高出站臺(tái)平面0.5 cm，將水用奶粉調(diào)成白色，以肉眼看不見平臺(tái)為準(zhǔn)，保持水溫(21±0.5) ℃。房間內(nèi)光照恒定，保持完全安靜，無光線直射在水池內(nèi)。

先對樹鼩進(jìn)行水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練，再進(jìn)行正式指標(biāo)檢測。

2.3.1 水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練 將樹鼩頭朝池壁放入水中，引導(dǎo)樹鼩找到水下平臺(tái)。放入位置隨機(jī)取東北、西北、東南、西南4個(gè)起始位置之一。記錄樹鼩找到水下平臺(tái)的時(shí)間(s)。在前幾次訓(xùn)練中，如果這個(gè)時(shí)間超過75 s，則引導(dǎo)樹鼩到平臺(tái)。讓樹鼩在平臺(tái)上停留10 s。連續(xù)訓(xùn)練7 d，每天2次，篩選游泳能力好，能自主找到平臺(tái)的樹鼩進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 正式指標(biāo)檢測 定位巡航實(shí)驗(yàn)(navigation test)在08∶30—10∶00進(jìn)行，每次75 s，連續(xù)測試4 d。將樹鼩隨機(jī)地頭朝池壁按東北、西北、東南、西南4個(gè)象限輕輕放入池中，記錄樹鼩尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間即逃避潛伏期和游泳速度。樹鼩找到平臺(tái)后使其在平臺(tái)上停留10 s，讓其適應(yīng)平臺(tái)站立和周圍環(huán)境，如果樹鼩在75 s內(nèi)未找到平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，記錄逃避潛伏期時(shí)間為75 s，并由實(shí)驗(yàn)者將樹鼩引導(dǎo)至平臺(tái)，讓其停留15 s。每次訓(xùn)練結(jié)束，迅速用吸水毛巾將樹鼩毛發(fā)擦干，并用電吹風(fēng)吹干，以防樹鼩低體溫。

空間探索實(shí)驗(yàn)(probe test):定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日撤走平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將樹鼩面向池壁放入水中，游泳時(shí)間均為90 s，記下其穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)，以此作為空間記憶力的成績。

2.4 病理學(xué)檢測

行為學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)束后，采用1%戊巴比妥鈉溶液按每100 g體質(zhì)量0.15 mL對樹鼩腹腔注射麻醉。待樹鼩麻醉后固定，從胸骨劍突處開胸，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，快速灌注生理鹽水100 mL沖洗血液，之后用4%多聚甲醛500 mL灌注，取腦組織后立刻固定于4%中性福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察腦組織形態(tài)改變，神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)形成情況用Bieloschsky鍍銀法檢測。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)觀察

3.1.1 定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果 空白組與對照組的學(xué)習(xí)進(jìn)度類似，隨著時(shí)間延長，潛伏期下降，兩組之間沒有明顯的差別。模型組從第3天開始，潛伏期明顯長于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，從第4天起與對照組也出現(xiàn)明顯差異(表1，圖1)。

3.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示在搜索策略上，空白組和對照組樹鼩有一定的趨向性，更傾向于在原有平臺(tái)的象限進(jìn)行搜索，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組則出現(xiàn)隨機(jī)搜索的趨勢，模型組與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在游泳速率上3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 3組樹鼩在定位巡航實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期

表2 3組樹鼩空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 HE染色 模型組樹鼩海馬皮質(zhì)HE染色切片可觀察到膠質(zhì)細(xì)胞增生，而空白組和對照組未見明顯病理改變(圖1)。

3.2.2 Bieloschsky鍍銀法 Bieloschsky 鍍銀法切片可以看到模型組樹鼩海馬形成NFT，而空白組、對照組均未看到明顯病理改變(圖2)。

4 討論

AD模型目前主要有老化型動(dòng)物模型(Kimuraetal.,2004)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型(Mirandaetal.,2010)和損傷型動(dòng)物模型(Schliebs & Arendt,2011)等，損傷型動(dòng)物模型被多數(shù)研究者采用。本實(shí)驗(yàn)采用的造模方法是Aβ、IBO、D-gal聯(lián)合使用的方法，此造模方法在大鼠身上已經(jīng)取得了成果，在獼猴身上也有聯(lián)合使用多種藥物制作AD模型的報(bào)道(李文德等，2010)。單一的物理或者化學(xué)因素造成動(dòng)物腦組織損傷的造模方法，都只能模擬AD表現(xiàn)的一個(gè)方面，聯(lián)合使用多種藥物更能表現(xiàn)AD復(fù)雜的病理過程。

在對樹鼩的水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，AD模型組的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，但沒有發(fā)現(xiàn)樹鼩在水中的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力受到明顯影響。腦內(nèi)注射制作神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的缺陷之一就是會(huì)對腦組織產(chǎn)生物理破壞，形成類似外傷的損害，從而產(chǎn)生一定的干擾，利用微泵注射技術(shù)能減小物理損傷，但也不是完美的解決方案。為了排除注射器貫穿腦組織對樹鼩智力的損傷，我們設(shè)計(jì)了腦內(nèi)注射生理鹽水的對照組，結(jié)果表明生理鹽水腦內(nèi)注射未對樹鼩的水迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)產(chǎn)生明顯影響。證明AD模型組的學(xué)習(xí)記憶能力下降確實(shí)是藥物毒性作用引起的，而不是物理損傷的結(jié)果。

圖1 樹鼩海馬HE病理組織圖片

Fig. 1 Histopathological changes in hippocampus ofTupaiabelangeri, using HE staining

A. 空白組, B. 對照組, C. 模型組。

A. Blank group, B. Control group, C. Model group.

圖2 樹鼩海馬Bieloschsky鍍銀法病理組織切片

AD動(dòng)物模型成立的判定指標(biāo)一般是將行為學(xué)觀察同病理檢測相結(jié)合。目前還沒有樹鼩AD模型的判定標(biāo)準(zhǔn)。我們參考大鼠AD模型和獼猴AD模型的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)。大鼠AD模型的行為學(xué)觀察指標(biāo)是經(jīng)典的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過訓(xùn)練，樹鼩也能適應(yīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。所以我們采用Morris水迷宮來作為樹鼩學(xué)習(xí)記憶能力測試的方法。AD的病理特征為額顳葉和海馬等部位出現(xiàn)選擇性膽堿能神經(jīng)元和突觸缺失、老年斑(senile plaques)和NFT(St George-Hyslop & Fraser,2012)，在大鼠AD模型(武聰?shù)龋?012)，獼猴AD模型(李文德等，2010)中，海馬病理都出現(xiàn)了膠質(zhì)細(xì)胞增多和NFT，是AD模型公認(rèn)的病理指標(biāo)。病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)模型組樹鼩出現(xiàn)了膠質(zhì)細(xì)胞增多和NFT，是典型的AD表現(xiàn)。綜合Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為模型組樹鼩符合AD的主要表現(xiàn)，模型是成立的。

綜合行為學(xué)觀察和病理學(xué)檢測結(jié)果，表明腹腔注射D-gal，雙側(cè)海馬注射Aβ1～42和IBO混合液的方法可以造成樹鼩學(xué)習(xí)記憶能力下降，并出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和NFT，是一種可行的樹鼩AD模型造模方法。

本研究目前只進(jìn)行了表觀現(xiàn)象的觀察，對于模型機(jī)理機(jī)制的研究還有待下一步用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行研究和探索。

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Establishment of the Alzheimer’s Disease Model inTupaiabelangeri

OUYANG Yiqiang1, HU Bing1, ZHANG Ying2, LUO Shaoshi1, LIANG Jinning1, LI Jiafu1, GUO Songchao1*

(1. Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China;2. Biological Targeting Therapy & Diagnosis Center of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

Objective To explore the feasibility of establishing Alzheimer’s disease (AD) animal model with tree shrew (Tupaiabelangeri). Method 30 adult male tree shrews were randomly divided into three groups. Intraperitoneal injection of D-galactose (D-gal) was made to the model group causing acute aging, then the mixture of amyloid protein β1～42 fragment (Aβ1～42) and ibotenic acid (IBO) was injected once into the bilateral hippocampus of the tree shrews; all those drugs were replaced with normal saline in equivalent doses for the control group, while no treatment was done to the blank group. Then behavioral test was conducted to the three groups of tree shrew through Morris water maze, and pathological detection and analysis was made through HE staining and silver impregnation staining. Result Morris water maze test suggested that significant learning and memory dysfunction occurred on the model tree shrews. The pathological detection indicated that significant gliosis and neurofibrillary tangles occurred at the cerebral hippocampus of the model group. No significant pathological changes happened on the control group and the blank group. Conclusion Intraperitoneal injection of D-gal and injection of the mixture of Aβ1～42 and IBO into the bilateral hippocampus would cause decline in learning and memory ability of the tree shrews, as well as gliosis and neurofibrillary tangles, thus it was a feasible modeling method of AD model with tree shrew.

Tupaiabelangeri; Alzheimer’s disease; animal model

2015-09-17 接受日期：2015-12-15 基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560612); 廣西科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(12-97-23)；廣西自然科學(xué)基金回國基金項(xiàng)目(2012GXNSFCA053005)；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2013GXNSFAA019147)

歐陽軼強(qiáng)(1977—), 博士研究生, 從事人類疾病動(dòng)物模型研究

*通信作者Corresponding author， 博士生導(dǎo)師, 研究方向: 營養(yǎng)與疾病, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué), E-mail：2433164518@qq.com

Q95-33

A

1000-7083(2016)02-0270-05