吡格列酮對MZT期小鼠胚胎發育阻滯的影響

徐禮杰，李鐘淑，方南洙

(延邊大學農學院 動物科學系，延邊 133002)

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吡格列酮對MZT期小鼠胚胎發育阻滯的影響

徐禮杰，李鐘淑，方南洙*

(延邊大學農學院 動物科學系，延邊 133002)

本研究旨在了解活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、發育阻滯與抗氧化物吡格列酮(Pioglitazone，PIO)之間的關系。試驗分3組：對照組、H2O2處理組和H2O2+PIO處理組。通過H2O2建立小鼠胚胎氧化損傷模型，添加抗氧化物質PIO對胚胎進行氧化修復， DCHFDA測定胚胎內部ROS水平，半定量PCR測定母型-合子型胚胎內部相關母性效應基因和合子型基因的表達。結果表明：(1)1-細胞和2-細胞胚胎H2O2處理組的ROS水平明顯比對照組和H2O2+PIO處理組的高(P<0.05)；(2)H2O2處理組的2-細胞向4-細胞過渡率明顯比對照組和H2O2+PIO處理組低(P<0.05)，但各處理組之間1-細胞向2-細胞過渡率差異不顯著(P>0.05)；(3)H2O2處理組的母性效應基因Hsf1、Zfp3612、Zp3和合子型基因Eif1-α、Zscan4d和Muerv-L的表達明顯比對照組和H2O2+PIO處理組低(P<0.05)。綜上表明，氧化應激通過下調2-細胞胚胎母型效應基因和合子型基因表達，導致小鼠胚胎2-細胞發育阻滯，抗氧化物質吡格列酮可促進胚胎發育，有效克服胚胎體外2-細胞發育阻滯現象。

吡格列酮；氧化應激；發育阻滯；母性效應基因；合子型基因

小鼠胚胎早期發育期間，2-細胞胚胎形成標志著胚胎發育從母性效應基因向合子型基因過渡(Maternal to Zygotic transition, MZT)[1]，這是大部分多細胞動物的一個現象[2]。卵子發生時期，卵母細胞合成母性效應mRNA和蛋白質直至卵子形成，這些物質將執行早期胚胎生物合成，指導第一次減數分裂以及指定最初的細胞命運和模式[3]。受精后，卵母細胞啟動母性mRNA降解，這個過程是在2-細胞末期完成的。隨著母性效應mRNA降解，受精卵的合子型基因激活(Zygotic gene activation, ZGA)并進一步加快母性mRNA降解[3]。胚胎的發育調控實現從母性效應基因向合子型基因過渡，合子型轉錄物指導胚胎進一步發育。因此，ZGA是胚胎繼續發育的基本條件。延伸啟動因子1a(Elongation initiation factor 1a, Eif1-a)、熱休克蛋白70.1(Heat-shock protein 70.1, Hsp70.1)、鼠內源逆轉錄病毒樣基因(Murine endogenous retrovirus-like, Muerv-L)以及鋅指和SCAN結構域4d(Zinc finger and SCAN domain-containing protein 4d, Zscan4d)是ZGA的內源性標記基因[4]。通過基因敲除的方法，越來越多的母性效應基因及其功能得到確認。如早期胚胎中缺失熱休克因子1(Heat-shock factor 1, Hsf1)[5]、合子阻滯因子1(Zygote arrest 1, Zar1)[6]等將會導致胚胎1-細胞發育阻滯，缺失ZFP36環指蛋白2(ZFP36 ring finger protein like 2, Zfp36l2)[7]、透明帶蛋白3(Zona pellucida protein 3, Zp3)[8]、胚胎必要的母體抗原(Maternal antigen that embryos require, Mater)[9]等導致2-細胞發育阻滯。

在體外培養過程中，許多胚胎由于ZGA延遲導致胚胎發育阻滯而死亡[10]。小鼠胚胎發育阻滯通常發生在2-細胞時期而被稱為“2-細胞發育阻滯”。在過去的幾十年里，人們花費了大量時間去探究2-細胞阻滯的原因。M.H.Nasr-Esfahani等[11]通過分析小鼠植入前胚胎中H2O2水平發現，2-細胞中期小鼠胚胎中H2O2含量上升，這個時期剛好與小鼠胚胎ZGA時期相吻合。因此，有學者將小鼠2-細胞發育阻滯與胚胎內部上升的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平相關并證實高濃度ROS抑制胚胎分裂，影響母性效應基因向合子型基因過渡[12]。孕前砷暴露可導致胚胎ROS水平明顯升高[13]，使小鼠植入前胚胎大部分阻滯在1-細胞和2-細胞。此外，培養基中添加過氧化氫酶抑制劑可導致胚胎發育阻滯的發生[14]。結果表明，ROS是導致哺乳動物胚胎體外發育阻滯的原因之一。

活性氧是指氧自由基和氧化作用較強的非自由基含氧產物。體外培養條件能造成各種細胞應激因子增加，包括氧化劑和異常細胞成分[15]，從而導致體外胚胎ROS積累，降低胚胎的質量[16]和阻礙胚胎的發育[17]。利用抗氧化酶能夠提高胚胎體外發育效率，降低胚胎氧化應激，如CAT[18]、SOD[18-19]和GSH[20]。PPARγ被認為是一種新型的抗氧化因子[21]，參與氧化應激相關信號通道中。PPARγ可增加NRF2表達，激活的NRF2可促進ARE介導抗氧化基因表達[22-24]。PPARγ可抑制ROS主要生產場所之一的NADPH氧化酶的表達[25]。PPARγ的其中一種特異性激動劑，吡格列酮可降低NOX1的mRNA和蛋白水平以及NADPH氧化酶活性，提高抗氧化物Cu/Zn-SOD和Mn-SOD蛋白的水平，從而調節細胞內部ROS水平[26]。

本研究通過檢測氧化損傷胚胎及吡格列酮修復氧化損傷胚胎中相關母性效應基因和合子型基因的表達水平，進一步探明ROS、胚胎發育阻滯與吡格列酮的關系，為吡格列酮抑制ROS誘導的胚胎發育阻滯提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

所用的動物為性成熟的昆明白系小鼠，購自延邊大學實驗動物中心。飼養在24 ℃環境中，光周期為12 h(8:00-20:00)，暗周期為12 h(20:00-8:00)。

1.2 試劑

孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)購自寧波激素有限公司；吡格列酮(Pioglitazone, PIO)購自Selleckchem；Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒購自凱杰公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶生物公司；2×Taq PCR MasterMix購自天根基因公司；其他相關藥品非特殊說明均購自Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 胚胎的收集及培養 挑選健康母鼠于第1天的17:00腹腔注射10 IU PMSG，時隔48 h腹腔注射10 IU hCG，然后與公鼠1∶1合籠，合籠15 h后檢查陰道栓。注射hCG 22 h后，脫頸處死見栓母鼠，打開腹腔取出輸卵管，顯微鏡下挑破輸卵管壺腹部。300 mg·L-1透明質酸酶脫去卵丘細胞，然后用M2清洗3遍，除去透明質酸酶。收集的胚胎在相應培養液中清洗3遍后，轉移到相應培養液小滴中，在飽和濕度、5% CO2氣相條件、37 ℃的培養箱中培養48 h，之后將其換成M16培養液孵育。

1.3.2 氧化損傷以及氧化修復胚胎模型的建立 收集的胚胎置于25 μmol·L-1的H2O2中孵育30 min后，分別在M16培養液和添加有5 μmol·L-1吡格列酮的培養液中清洗3遍，轉移到相應培養液小滴中進行培養。未經H2O2處理的胚胎用作對照組。

1.3.3 胚胎內部ROS含量的檢測 胚胎置于1 g·L-1PVA小滴中，洗滌2遍，然后避光置于10 μmol·L-1的2’7’-二氯熒光素二乙酸鹽(DCHFDA)染色液微滴中，放入培養箱孵育15 min。將孵育后的胚胎用M2洗3遍，在熒光顯微鏡下熒光顯色。用Image J 1.49對熒光圖片量化分析，結果用平均相對熒光強度相對值表示。

Type: Vietnam. Transplant collected from Son La Province, Van Ho District, Tan Xuan Municipality, Cot Moc Village, at ca. 1000 m a.s.l. 20°40′33.3″N, 104°39′0.3″E, 10 Nov 2015, L. Averyanov, CPC 7158a,b /13279 (holotype, LE, not seen).

1.3.4 總RNA的提取及cDNA合成 胚胎培養5和20 h，分別收集1-細胞和2-細胞胚胎各200個。胚胎總RNA提取根據Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒用法說明進行操作。總RNA提取后，根據PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒用法說明進行反轉錄。合成的cDNA保存在-20 ℃備用。

1.3.5 半定量PCR 應用2×Taq PCR Master Mix進行PCR反應，25 μL體系:模板4 μL，5 μmol·L-1上下游引物(表1)各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 13 μL，ddH2O26 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min； 95 ℃變性30 s， 59～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環； 72 ℃延伸5 min。5 μL的PCR產物用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后用Lane 1D Analysis Software進行IOD值分析。

表1 引物序列

Table1 Primer sequences

引物名稱Primername基因鏈接號AccessionNo.上游引物(5'-3')Forwardprimer下游引物(5'-3')Reverseprimer退火溫度/℃Annealingtemperature擴增產物/bpProductHsf1NM008296ACAACAACATGGCTAGCTTCGGGAGTCCATACACTCCTGTTT59901Zar1NM174877CTCAGGACCCCGGTGATTCACTCGGCAGAACTGTTTGA592050Zfp36l2NM001001806CCTCCTTTGTGGTGGTTGTTACACTACGTGGTGGCAATGA59121MaterNM011860GAGCATCATGGAGGTGAAGAGCTTCTGGTTAATCAGCAGCCA59301ZP3NM011776ATGGCGTCAAGCTATTTCCTCCGTGCCAAAAAGGTCTCTACT59186Zscan4dNM001100186CCATCTCATAGTTCTGGTGTGCGCTCCTTAGTCTGCTTTTCTGG59166Eif1aNM010120CCAAAGAATAAAGGCAAAGGAGCTCACACCGTCAAAGCACATT59164Hsp70.1NM010478AAGAGGAAGCACAAGAAGGACAGCGTGATGGATGTGTAGAAGTC59160Muerv-LY12713CGCACAGCAGCAGTCTATTATCTCTTCTCCTCTTCGGTCAGTTG64203GAPDHBC023196CATCACCATCTTCCAGGAGCGGAGGGGCCATCCACAGTCTTC59357

1.4 數據分析

數據應用SPSS 17.0進行差異顯著性分析，結果用“平均值±SEM”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 吡格列酮對小鼠1-細胞發育的影響

2.1.1 吡格列酮對小鼠胚胎1-細胞向2-細胞過渡的影響 H2O2誘導小鼠胚胎氧化損傷后，再經5 μmol·L-1吡格列酮處理，其對胚胎1-細胞期過渡到2-細胞期的影響見表2，重復5次。對照組、H2O2處理組和H2O2+PIO處理組的1-細胞向2-細胞過渡率無顯著性差異(P>0.05)。說明H2O2不會對小鼠胚胎1-細胞發育形成阻滯。

表2 吡格列酮對小鼠1-細胞胚胎向2-細胞過渡的影響

Table 2 The effect of pioglitazone on mouse 1-cell embryos to 2-cell transition

組別Group合子數Zygotenumber1-細胞向2-細胞過渡率/%Rateofzygoticto2-celltransitionControl19190.39±1.75aH2O218889.77±0.82aH2O2+PIO16991.50±2.05a

同一列不同字母代表處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。下同

Different letters in the same column means significant difference between the treatments (P<0.05). The same as below

2.1.3 吡格列酮對小鼠1-細胞胚胎母性效應基因表達的影響 1-細胞胚胎母性效應基因電泳條帶見圖2A，其量化結果見圖2B。H2O2處理組母性效應基因Hsf1的表達水平明顯比對照組和H2O2+PIO處理組低(P<0.05)，但H2O2+PIO處理組仍顯著低于對照組(P<0.05)。Zar1在H2O2處理組和H2O2+PIO處理組中均沒有表達。

A.1-細胞胚胎內部ROS熒光染色圖(10×40)；B.1-細胞胚胎內部ROS熒光強度圖A. Fluorescence imaging of ROS in 1-cell embryos(10×40);B.Fluorescence intensity of ROS in 1-cell embryos圖1 1-細胞胚胎ROS熒光染色圖及其量化圖Fig.1 Fluorescence imaging of ROS and quantification in 1-cell embryos

A.Hsf1、Zar1和GAPDH基因PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；B.Hsf1和Zar1基因mRNA相對表達量A.1% agarose gel electrophoresis for the PCR amplification products of the Hsf1, Zar1 and GAPDH; B.Relative expression of Hsf1 and Zar1圖2 小鼠胚胎1-細胞期母性效應基因的表達Fig.2 The expression of maternal-effect genes in mouse 1-cell embryos

2.2 吡格列酮對小鼠2-細胞發育的影響

2.2.1 吡格列酮對小鼠胚胎2-細胞向4-細胞過渡的影響 H2O2誘導小鼠胚胎氧化損傷后，再經5 μmol·L-1吡格列酮處理，其對胚胎2-細胞向4-細胞過渡的影響見表3，試驗重復5次。對照組和H2O2+PIO處理組的2-細胞向4-細胞過渡率顯著比H2O2處理組高(P<0.05)。初步說明H2O2參與小鼠2-細胞胚胎發育阻滯。

2.2.2 吡格列酮對小鼠2-細胞胚胎ROS的影響 收集各處理組2-細胞胚胎，DCHFDA避光染色后，藍色波長光(535 nm)激發，熒光顯微鏡下觀察ROS的熒光強度(圖3A)，熒光圖片量化分析見圖3B。對照組和H2O2+PIO處理組在2-細胞時期顯著低于H2O2處理組(P<0.05)，而對照組與H2O2+PIO處理組沒有顯著性差異(P>0.05)。

表3 吡格列酮對小鼠2-細胞胚胎向4-細胞過渡的影響

Table 3 The effect of pioglitazone on mouse 2-cell embryos to 4-cell transition

組別Group2-細胞胚胎數2-cellnumber2-細胞向4-細胞過渡率/%Rateof2-cellto4-celltransitionControl16171.20±6.63aH2O218845.15±3.19bH2O2+PIO14674.93±3.90a

2.2.3 吡格列酮對小鼠2-細胞胚胎母性效應基因表達的影響 2-細胞胚胎母性效應基因電泳條帶見圖4A，其量化結果見圖4B。H2O2均能降低母性效應基因Mater、Zfp3612和Zp3的表達水平(P<0.05)。添加吡格列酮后，Zfp3612和Zp3的表達水平顯著比H2O2處理組高(P<0.05)，但仍然顯著低于對照組(P<0.05)。H2O2+PIO處理組Mater的表達水平比H2O2處理組低(P>0.05)。

2.3 吡格列酮對2-細胞胚胎合子基因表達的影響

2-細胞胚胎合子型基因電泳結果見圖5A，其量化結果見圖5B。H2O2均能降低合子型基因的表達水平，其中Eif1a、Muerv-L和Zscan4d顯著下降(P<0.05)。添加吡格列酮后，Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L和Zscan4d的表達水平顯著比H2O2處理組高(P<0.05)。

A.2-細胞胚胎內部ROS熒光染色圖(10×40)；B.2-細胞胚胎內部ROS熒光強度圖A.Fluorescence imaging of ROS in 2-cell embryos(10×40);B.Fluorescence intensity of ROS in 2-cell embryos圖3 2-細胞胚胎ROS熒光染色圖及其量化圖Fig.3 Fluorescence imaging of ROS and quantification in 2-cell embryos

A.Mater、Zfp3612、Zp3和GAPDH基因PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；B.Mater、Zfp3612和Zp3基因mRNA相對表達量A.1% agarose gel electrophoresis for the PCR amplification products of the Mater,Zfp3612,Zp3 and GAPDH; B.Relative expression of Mater,Zfp3612 and Zp3圖4 小鼠胚胎2-細胞母性效應基因的表達Fig.4 The expression of maternal-effect genes in mouse 2-cell embryos

A. Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L、Zscan4d和GAPDH基因PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；B. Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L和Zscan4d基因mRNA相對表達量A.1% agarose gel electrophoresis for the PCR amplification products of the Eif1a,Hsp70.1,Muerv-L,Zscan4d and GAPDH; B.Relative expression of Eif1a,Hsp70.1,Muerv-L and Zscan4d圖5 小鼠胚胎2-細胞合子基因的表達Fig.5 The expression of zygotic genes in mouse 2-cell embryos

3 討 論

已有研究報道，PPARγ激動劑具有抗氧化效果。GW1929可增加人多巴胺能神經元活性和保護它們免受H2O2誘導的氧化應激傷害[27]。羅格列酮通過上調UCP2的表達減輕ROS損傷以及血管平滑肌增殖和遷移，從而抑制內膜增生相關的血管疾病[28]。吡格列酮通過調控人冠狀動脈內皮細胞的脂過氧化反應，改善TNF-α誘導的氧化應激，從而減少細胞凋亡[29]。本研究通過DCHFDA測定2-細胞期胚胎內部ROS水平時發現，H2O2+PIO處理組的ROS水平顯著低于H2O2處理組，證實吡格列酮能夠降低H2O2誘導的胚胎內部ROS水平。

導致胚胎體外發育阻滯可分為外因和內因。外因是指植入前胚胎體外培養過程中，培養液的高滲透壓、輻射、胚胎代謝和試驗操作都會使胚胎產生過多ROS[13]。由于植入前胚胎尚不具有成熟的抗氧化系統，因此早期胚胎對氧化應激十分敏感，容易導致胚胎發育阻滯或延遲[13-14]。在CZB培養液中，谷氨酰胺被用來替代葡萄糖作為能量物質，其在克服2-細胞發育阻滯中起到積極作用[30]。這是由于CZB培養液中缺少由葡萄糖引起氧化應激[31]，這間接說明了ROS是導致小鼠2-細胞發育阻滯的原因之一。本研究中，H2O2誘導胚胎氧化應激并不能導致小鼠1-細胞胚胎發育阻滯，但可明顯導致小鼠2-細胞胚胎發育阻滯，添加吡格列酮后可有效改善小鼠2-細胞胚胎發育阻滯。

此外，胚胎發育阻滯也受內因影響。受精前，卵母細胞在體內儲備大量母性效應轉錄物和蛋白質，這些物質在ZGA前指導和調控胚胎早期發育，如果卵母細胞或胚胎中ROS積聚，造成母性效應基因損傷或減少，將危害隨后的細胞分裂[13]。J.T.Flood等[32]通過轉胞漿的研究提出，早期發育胚胎內母型mRNA缺乏可導致胚胎發育阻滯。本試驗通過測定1-細胞胚胎母性效應基因Hsf1、Zar1以及2-細胞母性效應基因Mater、Zfp36l2、Zp3的mRNA表達，證實H2O2可加快胚胎內部母性效應基因的降解，吡格列酮可延緩氧化損傷胚胎部分母性效應基因的減少，促進胚胎的發育。雖然H2O2導致Hsf1、Zar1表達量明顯下降，但是并沒有使胚胎發生1-細胞阻滯，這可能是氧化應激初期，胚胎內部結構和功能還完善，母型效應因子儲備量充足，從而使合子順利過渡到2-細胞。至于本次研究中Zar1經過處理后H2O2不顯條帶，可能是由于胚胎發育初期Zar1的表達量開始迅速下降[6]，再加上H2O2使部分Zar1降解，以致電泳不足以顯示微量DNA條帶的緣故。

2-細胞胚胎向4-細胞胚胎過渡還需要合子型基因的調控，而ZGA啟動依賴母性效應物質。氧化應激下，母性效應物質降解加快，使大部分胚胎在2-細胞缺少這些物質，ZGA啟動延遲，最終導致2-細胞發育阻滯。本試驗通過測定MZT期胚胎合子基因的表達情況，證實H2O2抑制合子基因Zscan4d、Eif1a和Muerv-L的表達，這與D.P.Chu等[33]利用鄰苯二甲基-單-乙基己基酯(MEHP)暴露建立胚胎氧化應激模型，導致合子基因Muerv-L表達下降相一致。然而，H2O2并不能明顯抑制Hsp70.1表達，與Y.Zhang等[34]利用ER抑制劑處理小鼠胚胎后得出的結論類似。添加吡格列酮處理后，氧化損傷胚胎內Eif1a、Hsp70.1、Muerv-L和Zscan4d的表達水平顯著升高，說明能促進氧化損傷胚胎合子型基因的表達，促進小鼠2-細胞胚胎向4-細胞過渡。

從氧化應激的角度推斷：氧化應激下，小鼠胚胎啟動自身防御系統，加快母性效應物質的消耗以抵御ROS對胚胎的傷害。在這個過程中，大部分母性效應物質的過度消耗甚至耗盡，導致合子型基因激活失敗，最終發生2-細胞發育阻滯?？寡趸镞粮窳型ㄟ^降低胚胎氧化應激水平，延緩母性效應基因的降解，增加合子型基因的表達，一定程度上促進了胚胎的發育。

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(編輯 程金華)

Effect of Pioglitazone on Development Block of Mouse Embryos during Maternal to Zygotic Transition

XU Li-jie，LI Zhong-shu，FANG Nan-zhu*

(DepartmentofAnimalScience，AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133002，China)

The aim of this study was to investigate the relationship of ROS, developmental block and pioglitazone as an antioxidant. The experiment was divided into 3 groups：Control group, H2O2group and H2O2+PIO group. The oxidative damage model of mouse embryos induced by H2O2was established and treated with or without pioglitazone. The ROS level after treatment with pioglitazone was measured by DCHF-DA and the expression of maternal effect genes and zygotic genes were analyzed by Semi-quantitative reverse transcription PCR. The results showed that: (1) the ROS level of H2O2group was significantly higher than control group and H2O2+PIO group in both 1-cell and 2-cell embryos (P<0.05); (2) the rate of 2-cell to 4-cell transition in H2O2group was significantly lower than control group and H2O2+PIO group (P<0.05), while the difference of 1-cell to 2-cell transition rate among the groups was not significant (P>0.05)；(3) the expression of maternal effect genes (Hsf1,Zfp3612,Zp3) and zygotic genes (Eif1-α,Muerv-L,Zscan4d) in H2O2group was lower than control group and H2O2+PIO group (P<0.05). The results provided a clear molecular aspect regarding the mechanism by which pioglitazone promoted embryos development and overcome 2-cell block.

pioglitazone; oxidative stress; development block; maternal effect gene; zygotic gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.011

2016-05-11

國家自然科學基金項目(31360546)

徐禮杰(1984-)，男，廣東順德人，博士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：dsd0765@163.com

*通信作者：方南洙，教授，E-mail: nzfang@ybu.edu.cn

Q813.7

A

0366-6964(2016)11-2240-08