內蒙古荒漠草原可培養放線菌的空間分布特征

賈美清，劉成寶，許 帥，李 陽，韓國棟，金寶花，鄒 玉，張國剛

（1.天津師范大學 a.天津市水資源與水環境重點實驗室，b.生命科學學院，天津 300387；2.內蒙古農業大學生態環境學院，呼和浩特 010019）

內蒙古荒漠草原可培養放線菌的空間分布特征

賈美清1a，劉成寶1b，許 帥1b，李 陽1b，韓國棟2，金寶花1b，鄒 玉1b，張國剛1b

（1.天津師范大學 a.天津市水資源與水環境重點實驗室，b.生命科學學院，天津 300387；2.內蒙古農業大學生態環境學院，呼和浩特 010019）

為了解土壤放線菌在內蒙古荒漠草原生態系統中的功能，運用稀釋平板涂布法和16SrRNA分子鑒定技術對該地區土壤可培養放線菌的空間分布及其與土壤環境的相關性進行分析.結果表明：0～10cm土層中可培養放線菌的數量最多，達到43.33×104～63.33×104CFU/g，遠遠超過另外2個土層；其次是10～20cm土層，其放線菌數量略高于20～30cm土層的數量.從0～30cm土層中共分離到26個放線菌菌株，其中15個菌株成功測序，屬于鏈霉菌科的鏈霉菌屬.0～30cm土壤中的優勢菌為藍色鏈霉菌，數量比例達到51.00%.可培養放線菌的數量與土壤含水量、速效磷、速效鉀和有機質含量呈正相關，與pH值呈負相關（P＜0.01），與土壤銨態氮和硝態氮含量均無統計學意義上的相關關系（P＞0.05）.

內蒙古荒漠草原；可培養放線菌；16S rRNA；土壤環境

荒漠草原是內蒙古草原的重要組成部分，也是我國重要的畜牧業基地，面積約1 130萬公頃，占內蒙古草原區草地面積的10.7%，是草原區向荒漠區過渡的草原生態類型[1].荒漠草原處在一個脆弱的生態環境帶上，與其他草原類型相比，其穩定性較差，對自然和人為的干擾較敏感[2].近年來，由于氣候變化和人類不合理的開發利用，如過度放牧等，荒漠草原退化加劇，直接威脅著草地的畜牧業生產和人類自身在此地的生存環境.目前，國內外學者對內蒙古荒漠草原進行了大量研究，在植被和生產力、氣候變化對草原生態系統、群落結構和土壤呼吸的影響等方面[3-7]取得了很大進展.在草原土壤微生物的生物量研究等方面也取得了一些成果[8-9]，但缺乏從純培養角度進行的放線菌在荒漠草原土壤中空間分布的研究.

土壤放線菌廣泛存在于各種類型土壤中，甚至在非洲沙漠、北極永久凍土層、重金屬污染地區以及營養貧乏環境中都有放線菌的存在.放線菌參與有機物質的分解和異養營養素循環，可以產生胞外酶分解多種蛋白質和脂類，也是抗生素等藥物的主要來源.特殊生境中的放線菌在長期適應過程中可調整其次級代謝過程，產生結構新穎、活性獨特的次級代謝產物，是重要的微生物資源之一[10].本研究運用稀釋平板法和16S rRNA分子鑒定技術對內蒙古荒漠草原可培養放線菌的數量、物種組成及其與土壤環境的相關性進行分析，了解荒漠草原可培養放線菌的組成和空間分布，為放線菌在荒漠草原生態系統中的功能研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 樣地概況

樣地位于內蒙古自治區中部城市烏蘭察布西北部的四子王旗（41°10′～43°22′N，110°20′～113°E），海拔1 456 m，植被類型為荒漠草原.該地區氣候類型為中溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫為3.4℃，6、7和8月份的月平均氣溫最高，多年平均值分別為21.5、24.0和23.5℃，≥10℃的年積溫為2 200～2 500℃.多年平均降雨量為248 mm，年均蒸發量為2 947 mm，降水量主要集中在 6—9月份，占全年降水總量的70%以上.

1.2 樣品采集和處理

土壤樣品于2012年8月采自內蒙古四子王旗地區.在四子王旗隨機設置6個1 m×1 m的樣方，樣方間隔2 m.在每個樣方內用對角線采樣法設4個采樣點，每個采樣點用土鉆采集0～10、10～20、20～30 cm的土樣各約50 g，分層混勻，采用四分法從每層混勻的土樣中取1份.將所取土樣分別均分為2份，用封口塑料袋密封，低溫4℃下帶回實驗室，一份立即進行土壤理化性質的測定，另一份置于冰箱中，冷凍條件下保存備用.

1.3 儀器和試劑

1.3.1 儀器

連續流動分析儀（AA3，德國Seal公司）；酸度計（PB-10，德國Sartorius公司）；透射防護蓋紫外分析儀及成像系統（UV215型，上海領成生物科技有限公司）；PCR儀（TC-960F，瑞士Blue Marlin公司）；紫外可見分光光度計（T6系列，北京普析通用儀器有限公司）；火焰光度計（fp6431型，上海精密科學儀器有限公司）.

1.3.2 試劑

Ezup柱式基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；EB染液（上海經科化學科技有限公司）.

1.4 土壤理化性質的測定

按照文獻[11]的方法進行土壤理化性質的分析測定：采用電位法測定土壤浸提液的pH，浸提液的質量濃度為0.4 mg/L；使用流動分析儀測定土壤浸提液的銨態氮和硝態氮，浸提液的質量濃度為0.2 g/L；采用105℃烘干比重法測定土壤含水量；采用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測定土壤有機質含量；采用NaHCO3浸提土壤速效磷，鉬藍比色法測定速效磷含量；采用NH4OAC浸提速效鉀，火焰光度法測定速效鉀含量.

1.5 土壤可培養放線菌的分離培養

采用高氏一號培養基培養土壤放線菌.取0.5 g土樣置于裝有100 mL無菌水和無菌玻璃珠的錐形瓶中，150 r/min振蕩30 min.取土壤懸液進行梯度濃度稀釋，土壤懸液的質量濃度為1×10-4g/mL時放線菌計數的菌落數范圍為30～300個，該質量濃度即為培養放線菌的土壤懸液最佳濃度.取0.2 mL該質量濃度下的土壤懸液，均勻涂布到直徑為90 mm的平板上，同一樣品分別設置3個重復.將平板置于28℃的恒溫培養箱中培養7 d后，參考文獻[12-14]進行放線菌的初步鑒定，并根據菌落特征對其進行分類、編號和菌落計數.最后挑選生長良好的菌落進行分離和純化.

1.6 土壤可培養放線菌的分子鑒定

1.6.1 土壤可培養放線菌的16S rRNA的PCR擴增

挑取有代表性的放線菌菌株，用DNA提取試劑盒來提取菌落的DNA，以其為模板進行PCR擴增.引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R

（5′-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′）.PCR反應體系為50μL：10×EsBuffer（含Mg2+）5μL，dNTP4μL（各2.5 mmol/L），上游引物2 μL，下游引物2 μL，Tap Es DNA聚合酶0.5 μL（5 U/μL），模板10 μL（10 ng/μL），加超純水至50 μL.PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃1 min、55℃45 s、72℃45 s，30次循環，最后72℃下延伸10 min.擴增后的PCR產物用質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.6.2 PCR產物測序分析

將電泳檢測出的放線菌16S rRNA條帶的PCR產物送交北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序.將測序結果與GenBank數據庫（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov）進行比對，下載高質量的最相似的序列進行系統發育分析.

1.7 數據處理

采用Excel軟件處理數據，使用Spss13.0軟件進行單因素方差（One-Way ANOVA）分析.采用LSD法比較不同土層中可培養放線菌數量的差異和土壤理化因子的差異是否具有統計學意義；利用Pearson相關檢驗各土壤理化因子與可培養放線菌的數量是否存在有統計學意義的相關性.

2 結果

2.1 可培養放線菌的數量

考察內蒙古荒漠草原土壤不同深度土層中的可培養放線菌的數量，結果如圖1所示.

圖1 不同土層可培養放線菌的數量Fig.1 Numberofculturableactinomycetesindifferentsoillayer

0～30cm土層中的可培養放線菌總量為60×104～108×104CFU/g.由圖1可以看出，0～10 cm土層數量最多，為43.33×104～63.33×104CFU/g，同其他土層的差異具有高度統計學意義（P＜0.01）；10～20 cm土層的數量下降幅度較大，為7.67×104～27.67×104CFU/g；20～30 cm土層的可培養放線菌數量略低于10～20 cm土層的數量，為8.63×104～20.03×104CFU/g.由此可見，土壤中的可培養放線菌主要集中在0～10 cm土層，隨著土層深度的增加，數量急劇下降.

2.2 可培養放線菌的結構特征

對分離出的可培養放線菌進行形態特征和16S rRNA基因序列的系統發育分析，結果如表1所示.

表1 分離出的土壤可培養放線菌與其關系最近的典型菌株間的系統發育關系Tab.1 Phylogenetic similarity between isolated culturable actinomycetes and their closest type strains

由表1可以看出，從內蒙古荒漠草原0～30 cm土壤中共分離到26個放線菌菌株.其中15個菌株成功測序，占已分離到的菌株種數的57.69%.通過形態特

征與基因序列分析，證實15個菌株均屬于鏈霉菌科（Streptomycetaceae）、鏈霉菌屬（Streptomyces）.這些菌株在GenBank上與最相似菌株的相似度均大于98%.有11個菌株由于測序失敗，因此定為未知菌株.

2.3 可培養放線菌在土壤中的分布

分析不同放線菌菌株在土壤中的分布情況，結果如表2所示.

表2 可培養放線菌所占比例Tab.2 Percentage of strains of culturable actinomycetes

由表2可以看出，在已明確分類地位的土壤放線菌菌株中，菌株FXJ1、FXJ14、FXJ20、FXJ39和FXJ61只分布在土壤的0～10 cm土層，其中菌株FXJ1和FXJ14的數量比例分別為3.13%和1.90%，其他3個菌株的數量比例均為1.30%.菌株FXJ3、FXJ33和 FXJ54只分布在0～20 cm土層.菌株FXJ2、FXJ18、FXJ21、FXJ38和FXJ73在0～30 cm的各土層中均有分布.在0～10 cm土層中，菌株FXJ73、FXJ2和FXJ54是可培養的優勢菌群；在10～20 cm土層中，菌株FXJ2、FXJ18和FXJ21是可培養的優勢菌群；在20～30 cm土層中，菌株FXJ73是可培養的優勢菌群.在未知放線菌中，菌株FXJ11、FXJ62、FXJ67只在0～10 cm土層中有分布；菌株FXJ10、FXJ19、FXJ35、FXJ43、FXJ70在各土層中均有分布；菌株FXJ15和FXJ12在0～10cm和20～30cm土層內有分布，并且在20～30cm土層內的數量高于0～10 cm土層.分析不同土層中的優勢菌群，結果發現，在0～10 cm土層內，FXJ35和FXJ67為優勢菌群；在10～20cm土層內，菌株FXJ10和FXJ70為優勢菌群；在20～30 cm土層內，菌株FXJ19和FXJ43為優勢菌群.

總的來看，在0～30cm土層中，菌株FXJ73，即藍色鏈霉菌的數量比例最高，達到51.00%，遠遠超過其他菌株；其次是未確定分類地位的FXJ10菌株，數量比例達到28.00%；再次是FXJ70、FXJ43和FXJ2，在土壤中的數量比例分別為25.88%、24.05%和24.11%.

2.4 可培養放線菌數量與土壤環境因子之間的關系

荒漠草原土壤理化性質的測定結果如表3所示.由表3可以看出，研究區域的土壤呈弱堿性，而且0～10 cm土層的堿性相對較弱.含水量由上到下逐漸減少，尤其是從10～20 cm到20～30 cm土層，含水量下降幅度較大.硝態氮、速效磷和速效鉀的含量從上到下呈遞減趨勢，尤其是硝態氮和速效鉀的含量在不同土層中的差異較大.銨態氮在10～20 cm土層中含量最高，有機質則是在0～10 cm土層中含量最高.

荒漠草原可培養放線菌的數量與土壤環境因子之間的相關性分析結果如表4所示.由表4可以看出，可培養放線菌的數量與土壤含水量、速效磷、速效鉀和有機質含量呈正相關，相關性具有高度統計學意義P＜0.01），與pH值呈負相關，相關性具有統計學意義（0.01＜P＜0.05）.與銨態氮和硝態氮含量沒有相關性.

表3 不同深度土壤理化性質Tab.3 Soil physicochemical characteristics in different soil layer

%

表4 可培養放線菌數量與土壤理化因子相關性分析Tab.4 Correlation analysis between culturable actinomycetes and soil physical chemical factors

3 討論與結論

本研究以純培養方法和基于16S rRNA基因序列的系統發育分析對內蒙古荒漠草原可培養放線菌的數量空間分布及其與土壤環境的相關性進行探討.從0～30 cm土壤中共分離到26個菌株，其中15個菌株可確定到種，均屬于鏈霉菌屬；11個菌株由于測序失敗，無法明確其分類地位.本研究結果證實了鏈霉菌屬是荒漠草原可培養放線菌的優勢類群，這與薛冬等[15]對肇慶星湖濕地可培養放線菌多樣性的研究以及李海云等[16]對河西走廊酒泉地區鹽堿土壤中可培養放線菌多樣性的研究結果一致.對不同土層中可培養放線菌的數量分布特征進行研究，結果發現不同土層中放線菌的數量分布趨勢為：0～10 cm＞10～20 cm＞20～30 cm.0～10 cm土層中可培養放線菌的數量顯著高于其他2個土層.這可能是由于0～10cm土層中的水分和養分相對豐富，土壤通氣性良好，即環境有利于放線菌的生長和繁殖，因此可培養放線菌數量最多.本研究中不同土層可培養放線菌的數量與土壤含水量、速效磷、速效鉀、有機質含量呈正相關，這也證實了放線菌在土壤中的空間分布主要受土壤環境的影響.

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（責任編校 紀翠榮）

Spatial distribution of culturable actinomycete in the desert steppe of Inner Mongolia，China

JIA Meiqing1a，LIU Chengbao1b，XU Shuai1b，LI Yang1b，HAN Guodong2，JIN Baohua1b，ZOU Yu1b，ZHANG Guogang1b
（1a.Tianjin Key Laboratory of Water Resources and Environment，1b.College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.College of Ecology and Environmental Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019，China）

To learn the function of soil actinomycete in the desert ecosystem in Inner Mongolia of China，the spatial distribution of culturable actinomycete and its correlation with soil factors were analyzed by dilution-plate method and 16S rRNA molecular identification technique.The results showed that the amount of actinomycete in 0-10 cm soil layer was 43.33× 104-63.33×104CFU/g，which was much more than those in 10-20 cm and 20-30 cm soil layers；the amount of actinomycete in 10-20 cm soil layer was in the second place，which was slightly more than that in 20-30 cm soil layer.26 strains were isolated from 0-30 cm soil，among which 15 strains were successfully sequenced and belonged to Streptomyces.Streptomyces cyaneus was the dominant strain in 0-30 cm soil layer，the percentage of which was up to 51.00%.The amount of culturable actinomycete was positively related to water content，available phosphorus，available potassium and soil organic matter content and negatively related with pH value，and the relationships had statistic significance（P＜0.01）.While it had no statistic correlations withandcontents of soil（P＞0.05）.

desert steppe of Inner Mongolia；culturable actinomycete；16S rRNA；soil environment.

Q142

A

1671-1114（2016）04-0050-05

2016-02-23

國家自然科學基金資助項目（31500365，31100330，31270502）；天津市科技支撐重點資助項目（15ZCZDSF00410）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃資助項目（12JCYBJC19700）；天津市“用三年時間引進千名以上髙層次人才”資助項目（5KQM110006）；天津師范大學引進人才基金資助項目（5RL111）.

賈美清（1978—），女，實驗師，主要從事土壤生態學方面的研究.

張國剛（1976—），男，副教授，主要從事土壤生態學方面的研究.