清腸化濕方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

趙 崧， 陸玥琳， 馮 皖， 沈 洪

(江蘇省中醫(yī)院消化科， 江蘇 南京 210029)

清腸化濕方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

趙 崧， 陸玥琳， 馮 皖， 沈 洪

(江蘇省中醫(yī)院消化科， 江蘇 南京 210029)

目的:探討中藥清腸化濕方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響。方法:收集江蘇省中醫(yī)院門診及住院治療的21例濕熱內(nèi)蘊(yùn)證輕型潰瘍性結(jié)腸炎患者，采用中藥清腸化濕方口服加灌腸治療，療程3個(gè)月。觀察單用中藥的療效，應(yīng)用特異性細(xì)胞固定及檢測(cè)法比較治療前后患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化，以配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:清腸化濕方治療后與治療前比較患者外周血CD3＋及CD4＋細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；CD8＋細(xì)胞數(shù)治療后與治療前相比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；CD4＋/CD8＋比值治療后與治療前相比升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 05)。結(jié)論:中藥清腸化濕方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群具有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)調(diào)整機(jī)體免疫反應(yīng)抑制腸道炎癥。

清腸化濕方； 潰瘍性結(jié)腸炎； T淋巴細(xì)胞亞群

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以結(jié)直腸的慢性復(fù)發(fā)性炎癥為特征的疾病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC活動(dòng)期的病機(jī)較多存在大腸濕熱，該證型的主要治法為清化腸道濕熱。清腸化濕方是本院沈洪教授以芍藥湯為主方，并且結(jié)合多年用藥經(jīng)驗(yàn)及單味中藥篩選實(shí)驗(yàn)逐步優(yōu)化而來(lái)的驗(yàn)方，在臨床中已取得較好的療效，并在前期研究中證實(shí)能夠抑制UC患者Th17細(xì)胞的生成與活化[1]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)UC患者外周血T細(xì)胞亞群的分析，探討清腸化濕方對(duì)UC患者免疫反應(yīng)的影響。

1　資料與方法

1.1診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn):UC診斷參照《炎癥性腸病診斷與治療共識(shí)意見(jiàn)》[2]。中醫(yī)辨證分型參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識(shí)意見(jiàn)》[3]。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn):符合UC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；且中醫(yī)辨證屬濕熱內(nèi)蘊(yùn)證；年齡18～65歲。排除以下情況:感染性結(jié)腸炎包括細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸蟲(chóng)病、腸結(jié)核等；克羅恩病、缺血性腸炎、放射性腸炎患者；有嚴(yán)重并發(fā)癥如局部狹窄、腸梗阻、腸穿孔、中毒性結(jié)腸擴(kuò)張、大出血、結(jié)直腸癌患者；具有其他原發(fā)性、繼發(fā)性感染性疾病患者。

1.3一般資料:臨床病例為2015年1月至2015年9月江蘇省中醫(yī)院脾胃病科門診及住院的41例UC活動(dòng)期患者，男20例，女21例，年齡20～60歲(中位年齡40.5歲)，病程0.5～6.0年。按Baron分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定內(nèi)鏡下黏膜表現(xiàn)[4]，組織學(xué)分級(jí)由本院2位病理科醫(yī)生閱片評(píng)定。41例UC活動(dòng)期患者中選擇屬于輕度且中醫(yī)辨證屬濕熱內(nèi)蘊(yùn)證者21例，年齡24～59歲(中位年齡42.6歲)，病程0.5～6.0年。21例患者納入研究前的3個(gè)月內(nèi)均未使用過(guò)美沙拉嗪及糖皮質(zhì)激素。本研究所涉及的倫理問(wèn)題經(jīng)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，并且所得外周血樣品得到患者的知情同意。

1.4治療方法:清腸化濕方，藥物組成:黃連6g，黃芩10g，白頭翁10g，煨木香10g，炒白芍20g，炒當(dāng)歸10g，肉桂3g(后下)，生甘草6g。水煎服，每天1劑，臨床可根據(jù)病情變化隨證加減；配合灌腸方(黃柏30g，石菖蒲20g，苦參10g，地榆30g，白及9g，三七粉3g，訶子10g，錫類散1.5g)，濃煎至120mL，每晚睡前灌腸1次，連續(xù)灌腸12d后停灌2d，中藥飲片由江蘇省中醫(yī)院藥房提供；錫類散為南通精華制藥股份有限公司生產(chǎn)，每支1.5g，批號(hào):51160101。療程為3個(gè)月。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法:療效判定:①完全緩解:患者臨床癥狀、體征完全消失，內(nèi)鏡下表現(xiàn)腸道黏膜無(wú)異常；②有效:臨床癥狀、體征基本消失，內(nèi)鏡下表現(xiàn)可見(jiàn)腸道黏膜輕微的炎性改變；③無(wú)效:患者臨床癥狀、體征無(wú)改善，甚至加重。總有效率＝(完全緩解例數(shù)＋有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。治療前后患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群分析:采用上海匯中細(xì)胞生物科技有限公司SemiBio CD系列(CD3/4/8)細(xì)胞檢測(cè)玻片分析。取患者靜脈血標(biāo)本，吸取20μL搖勻，EDTA抗凝全血加入380μL磷酸鹽緩沖液中，即刻混勻。將濕盒置于水平工作臺(tái)，加入室溫水直至濕盒底部被完全覆蓋。取出玻片，吸取5μL稀釋血樣，滴入玻片方框區(qū)域中央。蓋緊盒蓋，室溫孵育40min，將玻片按序插入玻片架，放入磷酸鹽緩沖液中，直至玻片呈無(wú)色透明。即刻放入過(guò)氧化酶染色液中，靜置1min。將略干燥后的玻片架放入新鮮的過(guò)氧化氫溶液中，靜置4min。再將玻片架轉(zhuǎn)入75%乙醇中清洗至干凈。將玻片置于SemiBio自動(dòng)玻片干燥儀下干燥6min，放入復(fù)染液中，靜置1min。轉(zhuǎn)入純水中，靜置30s，吹干。通過(guò)SemiBio全自動(dòng)可視化細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)、分析。該檢測(cè)方法正常參考值:CD3＋細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)770～2860個(gè)/μL，CD4＋細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)414～1440個(gè)/μL，CD8＋細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)238～1250個(gè)/μL，CD4＋/CD8＋比值0.7～2.87。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，治療前后各指標(biāo)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)作圖采用GraphPad Prism 6。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

圖1　治療前后CD3＋細(xì)胞比較

圖2　治療前后CD4＋細(xì)胞比較

圖3　治療前后CD8＋細(xì)胞比較

圖4　治療前后CD4＋/CD8＋比較

2.1臨床療效觀察:21例患者其中有1例患者實(shí)驗(yàn)期間加用美沙拉嗪治療，判定為病例脫落。20例患者單純使用清腸化濕方治療，其中12例完全緩解，6例有效，2例無(wú)效。總有效率達(dá)90%。

2.2患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較。患者治療后與治療前比較外周血CD3＋及CD4＋細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；CD8＋細(xì)胞數(shù)治療后與治療前相比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；CD4＋/CD8＋比值治療后與治療前相比升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(見(jiàn)表1及圖1～4)

表1　患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較(±s)

表1　患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較(±s)

時(shí)間CD3＋(個(gè)/μL)CD4＋(個(gè)/μL)CD8＋(個(gè)/μL)CD4＋/CD8＋治療前1381.50±292.15 711.45±153.29 593.95±119.44 1.21±0.19治療后1376.90±268.27 718.10±164.34 511.50±102.69 1.41±0.23 t0.18760.36455.2136.012 P0.85310.7195＜0.001＜0.001

3　討 論

本試驗(yàn)中患者外周血T淋巴細(xì)胞分析采用特異性細(xì)胞固定及檢測(cè)法，以細(xì)胞分離固定技術(shù)為基礎(chǔ)，利用抗原抗體特異性反應(yīng)，通過(guò)芯片基板達(dá)到將特異性細(xì)胞進(jìn)行固定、分離的目的，完成檢測(cè)。該方法與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)論相關(guān)性良好，檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，同時(shí)其操作簡(jiǎn)單，使用條件不苛刻。從檢驗(yàn)學(xué)角度，細(xì)胞絕對(duì)值比百分率更具有臨床價(jià)值。除了獲得細(xì)胞數(shù)量外，玻片可固定細(xì)胞，直接觀察細(xì)胞形態(tài)對(duì)其分析。

CD3＋細(xì)胞主要參與T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但整體水平基數(shù)較大，進(jìn)一步標(biāo)記的分類繁多，故不足以在治療前后顯示出差異。人體腸道內(nèi)的免疫系統(tǒng)由復(fù)雜的免疫細(xì)胞族群構(gòu)成，既能夠?qū)δc腔抗原形成生理免疫耐受，又可以提供抵御致病原的能力。固有免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)與適應(yīng)性免疫細(xì)胞(T細(xì)胞和B細(xì)胞)在黏膜中的異常滲透是活動(dòng)期UC的標(biāo)志性變化。CD4＋的效應(yīng)T細(xì)胞(Th1，Th2和Th17)是對(duì)抗病原體的關(guān)鍵，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以限制效應(yīng)T細(xì)胞的無(wú)限擴(kuò)大和過(guò)度反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)展缺陷或者免疫抑制屬性的改變將導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受喪失，最終平衡打破從而形成結(jié)腸炎癥。清腸化濕方在本實(shí)驗(yàn)中雖然取得較好療效，結(jié)腸炎癥減輕，但治療前后外周血CD4＋細(xì)胞數(shù)并未表現(xiàn)出顯著變化。可能由于CD4＋的效應(yīng)T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的此消彼長(zhǎng)，結(jié)果從整體水平上變化微弱，所以從CD4＋細(xì)胞的更具體分類亞群角度進(jìn)行研究或許可以獲得進(jìn)一步的數(shù)據(jù)。

細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD8表面蛋白被稱為CD8＋T細(xì)胞，CD8＋細(xì)胞能夠識(shí)別抗原，通過(guò)釋放穿孔素與顆粒酶發(fā)揮毒性殺傷作用將靶細(xì)胞溶解。UC患者的CD8＋細(xì)胞水平較高，可引發(fā)自身免疫炎癥，造成腸道組織損傷。同時(shí)細(xì)胞毒性T細(xì)胞還能夠產(chǎn)生和釋放促炎細(xì)胞因子以及化學(xué)因子，例如干擾素γ或者腫瘤壞死因子α，這些因子協(xié)助導(dǎo)致上皮細(xì)胞溶解，在上皮受到侵蝕的位置造成腸腔內(nèi)抗原的注入。治療后患者的CD8＋細(xì)胞數(shù)明顯降低，CD4＋/CD8＋比值明顯升高，闡明了清腸化濕方對(duì)于UC患者免疫狀態(tài)調(diào)節(jié)的正面作用。

[1] 陸玥琳，沈洪，姚宏鳳，等.清腸化濕方聯(lián)合美沙拉嗪顆粒對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者血漿及腸黏膜組織IL－17的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34(10):1160～1163

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組.炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)[J].胃腸病學(xué)，2012，17(12):763～781

[3] 中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì).潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識(shí)意見(jiàn)[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(6):891～895

1006－6233(2016)11－1920－03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.073

江蘇省中醫(yī)院院級(jí)課題項(xiàng)目，(編號(hào):Y13053)；國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)第二批科研專項(xiàng)，(編號(hào): JDZχ2015083)