人參銹腐病拮抗細菌的篩選與鑒定

摘要：從靖宇縣和長白山兩地土壤中分離出500 株細菌，從中篩選出20株對人參銹腐病菌（Cylindrocarpon destructans）具有明顯抑制作用的拮抗菌株。選擇抑菌效果最好的菌株CB206，對幾種常見病原菌進行抑菌譜試驗。結果表明：菌株和其發酵液對鐮刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻紋枯、玉米紋枯均有較好的抑菌效果。通過對其形態特征及16S rDNA序列分析研究，確定其為沙雷菌屬。

關鍵詞：人參銹腐病；拮抗細菌；篩選；鑒定

中圖分類號： S435.675 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.16.019

人參銹腐病作為對人參的主要病害之一，感染后參根出現不同程度的紅褐色腐爛斑[1]。長期以來人們一直依靠化學農藥對人參土傳病害進行防治，但并沒從根本上解決問題，利用有益微生物來對其進行防治，是具有無毒、無污害的一條有效途徑[2]。本研究從靖宇縣、長白山兩地土壤中分離細菌，并對其中抗人參銹腐病的菌株進行篩選與鑒定，期望得到具有商業價值的拮抗菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養基

人參銹腐病、鐮刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻紋枯、玉米紋枯。供試培養基為NA，PDA和BY培養基。

1.2人參土壤拮抗細菌的分離

取自靖宇縣和長白山土壤共85份。取各土樣5克，分別加入裝有50毫升無菌水的三角瓶中，搖床振蕩30分鐘，然后進行梯度稀釋。吸取稀釋液 100μL，放入事先準備好的NA 平板上均勻涂布，每個處理3次重復。稀釋度以每平板菌落數100～150為宜，于28℃下培養24小時。調取不同類型的菌落于 NA 平板上純化3次后 ，4 ℃ 保存于NA斜面上備用。

1.3 菌株及發酵液的拮抗活性測定

以人參銹腐病為指示菌進行拮抗活性測定。將病原菌放置PDA中央，將細菌劃線到四周，觀察有無抑菌圈出現，篩選優良拮抗菌株。

將上述具有拮抗性的菌株轉接至新鮮的斜面培養基上，28 ℃ 條件下培養1天后，接種至裝液50毫升的250毫升三角瓶內，在28℃、轉速為200轉/分鐘的旋轉式搖床上振蕩培養48小時，得發酵液。

發酵液經離心后與菌體分離，分別用乙酸乙酯和甲醇進行抽提，旋轉蒸發儀濃縮，將濃縮液加入到濾紙片中，進行對峙培養，觀察有無抑菌效果。

1.4 拮抗細菌的抑菌譜測定

對抑菌圈明顯、拮抗效果好的菌株進行抑菌譜測定，供試病原菌包括鐮刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻紋枯、玉米紋枯。方法同本文“1.3”。

1.5 16S rDNA基因序列測定

細菌總DNA提取用CTAB NaCl。PCR擴增采用通用引物27F，1492R。

PCR反應體系（20μL）擴增體系：10×擴增緩沖液（不含MgCl2）2.0μ L，MgCl21.0μL，dNTP （ 10 mmol/ L ） 1 μL，P1、P2（10μmol/ L）各1.0μ L，Taq 酶（215 U/μL） 0.5μL，DNA 1.0μL ，補加超純水至20μL。PCR程序：95 ℃預變性5分鐘 ；94 ℃變性60秒，56 ℃退火30秒，72 ℃延伸1.5分鐘，循環33 次，72 ℃最終延伸10分鐘。代表菌株的PCR產物測序由上海生工公司完成。測序結果用NCBI數據庫中的BLAST進行相似性分析，找到與其同源性較高的菌株。

2 結果與分析

2.1土壤拮抗細菌的分離

從兩地共分離出500株細菌，其中350株來源于長白山，150株來源于靖宇縣。

2.2土壤細菌拮抗活性的測定結果

對采自不同地區、不同地塊的85份土樣中分離得到的 500 株細菌進行室內抗菌活性測定。經過初篩、復篩，發現有10株菌株對人參銹腐病有明顯拮抗作用。其中菌株CB206 對人參銹腐病菌的抑菌效果最好。

2.3拮抗菌株CB206的抑菌譜測定

將菌株CB206與鐮刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻紋枯、玉米紋枯進行抑菌圈對峙培養試驗。CB206對幾種病原菌都要較好的拮抗效果，說明其有很好的光譜抗菌性，有較好的研究開發價值。

2.4拮抗細菌BS015的16S rDNA序列測定

以細菌的基因組DNA為模板，經過PCR擴增后，得到1條約1500 bp 的DNA 片段。將其測序，經過在NCBI數據庫中進行Blast相似性分析得其屬于沙雷菌屬。

3 結論與討論

本實驗從不同地區共篩選到20株有拮抗作用的細菌。對拮抗效果最好的菌株CB206進行16SrDNA基因序列和生理生化試驗，結果表明該菌株屬于沙雷菌屬。

本實驗篩選出的菌株CB206對人參銹腐病菌具有明顯的抑制作用，在抑菌譜試驗中發現CB206具有光譜抗菌性，可能是多種生防機制共同作用，例如產生抗生素、競爭、溶菌以及促生和誘導抗性等協同作用的結果。對于活性物質的篩選，盆栽試驗，安全性等問題，有待于進一步的研究。

參考文獻

[1] 赫榮琳，李玉，等.人參銹腐病接抗菌的篩選及鑒定[D].吉林農業大學，2006.

[2] 吳連舉，楊依軍，武俠，等.利用土壤拮抗微生物防治人參銹腐病[J].中國生物防治，1999，15（04）：166-168.

作者簡介：任飛娥，碩士，陜西省榆林農業學校，助理講師，研究方向：植物保護。