下調HER2降低自噬活性抑制人肺癌細胞增殖轉移作用的體外研究

馮媛媛，伍宏山，張志宏，龍新華，周揚，童未來，劉志禮，劉家明△

下調HER2降低自噬活性抑制人肺癌細胞增殖轉移作用的體外研究

馮媛媛1，伍宏山2，張志宏2，龍新華2，周揚2，童未來2，劉志禮2，劉家明2△

目的探討下調HER2表達是否抑制細胞自噬活性，從而影響人肺癌細胞的增殖、遷徙和侵襲。方法采用濃度5 μmol/L自噬抑制劑3-MA、10 μmol/L HER2抑制劑Neratinib分別作用人肺癌細胞A549。Western blot檢測肺癌細胞A549中HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達水平；Wound healing和Transwell invasion實驗檢測細胞遷徙、侵襲能力；四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細胞的增殖能力。結果Neratinib和自噬抑制劑（3-MA）作用24 h后，細胞HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達水平顯著低于陰性對照組；Neratinib、自噬抑制劑（3-MA）處理組的細胞增殖、遷徙和侵襲能力顯著低于陰性對照細胞。結論下調HER2能降低人肺癌細胞A549的自噬活性并抑制其增殖、遷徙和侵襲。

肺腫瘤；自噬；細胞增殖；受體，erbB-2；細胞侵襲；細胞遷徙

細胞自噬（autophagy or autophagocytosis）是細胞在自噬相關基因（autophagy related gene，Atg）的調控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程。有研究表明，包括肺癌在內多種腫瘤的形成與自噬過程密切相關［1-4］。同時也有研究顯示，HER2信號通路激活能改變細胞的自噬水平［5］。但是，HER2是否通過改變細胞自噬活性影響肺癌細胞的遷徙和侵襲及其分子機制尚不明確。本研究以人肺癌細胞株A549細胞為研究對象，用Neratinib處理人肺癌細胞株A549細胞，觀察A549細胞的自噬活性，為進一步探討HER2在肺癌細胞中的作用提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料（1）細胞株：人源肺癌細胞系A549細胞株購于上海中科院細胞庫。（2）試劑：DMEM（高）培養基（Solarbio公司）、胎牛血清（Trans Gen公司）、Transwell侵襲小室（8.0 μm孔徑PC膜，美國Corning公司）、基質膠（美國BD公司）、Western blot上樣蛋白Marker和PVDF膜（美國Formentas公司）、一抗（美國Santa Cruz公司）、二抗（北京中杉金橋公司）、Neratinib、3-MA（美國abmole）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將A549細胞置于DMEM高糖培養基中（內含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 mg/L），在37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中貼壁培養。

1.2.2Western blot檢測HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達水平10 μmol/L HER2抑制劑Neratinib、5 μmol/L自噬抑制劑（3-MA）作用人肺癌細胞A549 24 h（分別為Neratinib處理組、3-MA處理組），PBS替代藥物作為陰性對照組，收集細胞，RIPA裂解，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（鼠抗人HER2，1∶2 000；兔抗人Beclin-1，1∶1 000；兔抗人LC3B，1∶3 000；鼠抗人β-actin，1∶2 500）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（山羊抗鼠和山羊抗兔，1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，Pro-light HRP化學發光檢測試劑（TIANGEN，PA112）化學發光、壓片、拍照，用Image J軟件對條帶灰度值進行分析。實驗重復3次。

1.2.3 Wound healing檢測細胞遷徙能力取對數生長期細胞進行實驗，常規消化細胞，調整細胞濃度為5×105個/mL，接種于6孔細胞培養板，待細胞形成單層貼壁細胞，用10 μmol/L Neratinib、5 μmol/L 3-MA分別作用細胞（PBS替代藥物為陰性對照組）24 h后，用10 μL槍頭在單層細胞表面劃一直線。用PBS漂洗2次去除劃落的細胞；加入無血清DMEM高糖培養液繼續培養24 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕中細胞遷移情況并拍照，Image J軟件測量遷徙距離，計算各組細胞遷徙率。實驗重復3次。

1.2.4 Transwell invasion檢測細胞侵襲能力應用Transwell小室進行細胞侵襲實驗。將用10 μmol/L Neratinib及5 μmol/L 3-MA作用24 h后的細胞用無血清DMEM高糖培養基重懸，調整細胞濃度為5×105個/mL，取150 μL細胞懸液接種小室，然后將小室放入加有600 μL/孔含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基的24孔板中，常規培養24 h。取出小室，吸棄上室液體，用PBS漂洗2次，95%乙醇固定10 min，用棉簽擦凈小室膜上側未遷移的細胞，4 g/L結晶紫染色20 min，PBS漂洗2次。倒置顯微鏡下隨機讀取10個視野，觀察細胞穿膜情況并拍照，Image J分析軟件計數。實驗重復3次。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細胞增殖能力根據預實驗的結果，選取效果最好的10 μmol/L Neratinib、5 μmol/L 3-MA作為最終實驗濃度。取對數生長期細胞進行實驗，常規消化貼壁細胞，調整細胞濃度為1×104/mL接種于無菌96孔培養板，每孔100 μL，常規培養12 h。待細胞貼壁良好，分別加入濃度10 μmol/L Neratinib、5 μmol/L 3-MA作用24、48、72、96 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL。孵育4 h后，吸棄各孔培養液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL。微振蕩10 min，用酶標儀檢測波長490 nm處光密度（OD）值。實驗重復3次。

1.3 統計學方法用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，數據以表示，各組細胞遷徙、侵襲及增殖能力差異情況比較采用方差分析和LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Neratinib及3-MA對A549細胞自噬相關蛋白Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）表達的影響與陰性對照組相比，3-MA處理組的Beclin-1蛋白及LC3BⅡ/Ⅰ表達水平明顯降低；Neratinib處理組的HER2、Beclin-1蛋白及LC3BⅡ/Ⅰ表達水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。提示在人源肺癌A549細胞中，改變HER2的表達能調控細胞自噬的活性。

Fig.1The effect of Neratinib and 3-MA on Beclin-1 and LC3B(Ⅱ/Ⅰ)protein expressions in A549 cells圖1 Neratinib及3-MA對A549細胞蛋白Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）表達水平的影響

2.2 Neratinib及3-MA對A549細胞遷徙能力的影響Neratinib處理組、3-MA處理組24 h遷徙率分別為11.1%±1.4%、10.5%±1.2%，均低于陰性對照組的42.9%±2.4%，差異均有統計學意義（F=27.430，P＜0.05），見圖2。提示HER2低表達及細胞自噬活性水平能降低抑制肺癌細胞系A549細胞遷徙。

2.3 Neratinib及3-MA對A549細胞侵襲能力的影響Neratinib處理組、3-MA處理組穿膜細胞數分別為40±8、59±10，均顯著低于陰性對照組的113± 13，差異均有統計學意義（F=18.246，P＜0.05），見圖3。提示HER2低表達及細胞自噬活性水平降低能抑制肺癌細胞系A549細胞侵襲。

2.4 Neratinib及3-MA對A549細胞增殖能力的影響與陰性對照組比較，在作用48、72、96 h后Neratinib及3-MA能有效抑制A549細胞的增殖（F分別為15.213、4.965、5.366，均P＜0.05），見圖4。

3 討論

細胞自噬作為真核生物界一種普遍存在的生命現象，對生物的發育、生長等多種過程具有重要的生理意義［6］。細胞自噬（又稱為Ⅱ型細胞死亡），是細胞在自噬相關基因的調控下，膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等形成自噬體［7］，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞穩態和細胞器的更新［8-10］。無論是腫瘤細胞還是正常細胞，保持一種基礎、低水平的自噬活性是至關重要的。生物體內破損或衰老的細胞器、長壽命蛋白質、錯誤合成或折疊的蛋白質等都需要及時清除，而這主要靠自噬來完成，因此，自噬具有維持細胞自穩的功能。同時，自噬的產物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質又可為細胞提供一定的能量和合成底物。而腫瘤細胞本身具有高代謝的特點，對營養和能量的需求比正常細胞更高，所以細胞自噬水平對腫瘤細胞的形成具有重要意義。

Beclin-1基因是酵母Atg6基因的同源體，作為一種抑癌基因，在腫瘤的形成中起著重要作用［11］。有研究表明上調Beclin-1可以促進自噬的發生［12］。進一步研究發現，Beclin-1主要通過與PI3K結合后與之形成復合體，調節其他自噬相關基因，進而調節細胞自噬水平，因此，Beclin-1與細胞的自噬活性具有密切聯系［13-14］。

Fig.2The cell migration ability detected by Wound healing assay in three groups of A549 cells圖2 Wound healing實驗檢測3組A549細胞的遷徙能力

Fig.3The cell invasion ability detected by Tanswell invasion assay in three groups of A549 cells圖3 Transwell invasion實驗檢測3組A549細胞的侵襲能力

Fig.4The cell proliferation detected by MTT assay in three groups of A549 cells圖4 MTT實驗檢測3組A549細胞的增殖能力

LC3是一種可以用來示蹤自噬形成的蛋白，對細胞自噬體的形成至關重要，其存在兩種形式：LC3-Ⅰ（胞漿型）與LC3-Ⅱ（膜型）。當細胞內自噬水平被激活時，胞漿型LC3經過泛素樣的加工修飾后形成膜型LC3［15］，而LC3有3種同源基因，即LC3A、LC3B及LC3C，其中LC3B已被證實位于自噬溶酶體上，因此LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可作為檢驗自噬發生的指標［16-17］。

人類表皮生長因子受體2（HER2/neu）是由位于染色體17q21上的原癌基因ErbB2/HER2/neu編碼的一種跨膜受體酪氨酸激酶，激活胞內信號通路從而參與細胞內信號的傳導［18-19］。且HER2在多種腫瘤組織中呈現高表達，與腫瘤的不良預后密切相關［20-21］。也有研究表明，HER2激活RAS-MAPK和PI3K分別促進和抑制細胞的自噬活性［5］。但是HER2是否通過改變自噬活性從而影響肺癌細胞的惡性表型尚不明確。筆者推測HER2可能通過調節肺癌細胞的自噬水平，從而改變其惡性表型。

為了證實此推測，本組實驗利用自噬抑制劑3-MA處理人肺癌細胞系A549，PBS替代作為陰性對照，結果顯示經3-MA處理后的肺癌A549細胞的增殖遷徙和侵襲能力明顯被抑制，且自噬相關蛋白Beclin-1、LC3B（Ⅱ/Ⅰ）表達降低，這提示下調自噬水平能抑制肺癌細胞A549的增殖、遷徙和侵襲能力。同時利用HER2抑制劑Neratinib處理人肺癌細胞系A549，PBS替代作為陰性對照，經Western blot檢測顯示在處理的細胞中HER2、Beclin-1及LC3B（Ⅱ/Ⅰ）蛋白表達水平顯著低于陰性對照組，這提示改變HER2在肺癌A549細胞中的表達水平能顯著改變肺癌細胞的自噬水平。采用MTT、Wound healing和Transwell invasion實驗檢測細胞增殖、遷徙和侵襲情況，結果顯示Neratinib處理的細胞增殖、遷徙和侵襲能力顯著低于陰性對照組細胞，這些結果表明HER2在肺癌細胞遷徙侵襲中起著重要作用。

綜上，下調HER2可使肺癌細胞的自噬活性下降，進而抑制肺癌細胞的增殖、遷徙和侵襲，為肺癌的轉移防治提供了新思路。但是，本研究僅采用一種細胞系進行體外研究，而細胞的自噬水平還需更多的相關實驗檢測。此外，體內微環境對腫瘤細胞的增殖侵襲轉移非常重要，因此還需進一步的體內、外實驗來證實HER2調控細胞自噬的水平對肺癌細胞增殖、遷徙和侵襲的影響。

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（2016-07-10收稿2016-08-30修回）

（本文編輯閆娟）

The inhibition of autophagy suppresses proliferation and metastasis of lung cancer cells via down-regulation of HER2

FENG Yuanyuan1,WU Hongshan2,ZHANG Zhihong2,LONG Xinhua2,ZHOU Yang2, TONG Weilai2,LIU Zhili2,LIU Jiaming2△
1 Department of Basic Medicine,Nanchang University,Nanchang 330006,China; 2 Department of Orthopdeics,the First Affiliated Hospital of Nanchang University△

ObjectiveTo investigate whether the down-regulation of HER2 can inhibit the autophagy of cells and influence the proliferation and metastasis of lung cancer cells.MethodsThe 5 μmol/L of autophagy inhibitor(3-MA)and 10 μmol/L of HER2 inhibitor(Neratinib)were used to treat human lung cancer A549 cells.Western blot assay was used to detect the protein expressions of HER2,Beclin-1 and LC3B(Ⅱ/Ⅰ)in A549 cells.Wound healing and Transwell invasion methods were used to detect the invasion and migration ability of A549 cells.MTT assay was performed to evaluate the cell proliferation.ResultsWestern blot analysis showed that the protein expressions of HER2,Beclin-1 and LC3B(Ⅱ/Ⅰ) were significantly declined in A549 cells treated with Neratinib and 3-MA for 24 h compared to cells in control group.The cell proliferation,migration and invasion ability were significantly decreased in A549 cells treated with Neratinib and 3-MA thanthoseofcontrolcells.ConclusionTheinhibitionofHER2proteincansuppresstheautophagyandproliferationofA549cells.

lung neoplasms;autophagy;cell proliferation;receptor,erbB-2;cell invasion;cell migration

R734.2

A

10.11958/20160610

江西省自然科學基金項目（2014ZBAB205012，20151BAB215026）

1南昌大學基礎醫學部（郵編330006）；2南昌大學第一附屬醫院骨科

馮媛媛（1994），女，碩士研究生，主要從事腫瘤的分子機制方面研究

△通訊作者E-mail:liujiamingdr@hotmail.com