MK801對結腸癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響

謝冬冰，孟建宇，郭玉婷，任霞，李雪

MK801對結腸癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響

謝冬冰1，孟建宇2，郭玉婷3Δ，任霞4，李雪1

目的探究N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型1（NMDAR1）在結腸癌細胞HT29和SW116中的表達，以及NMDAR1拮抗劑MK801對HT-29和SW116細胞生長抑制、凋亡和遷移的影響。方法采用免疫組織化學法檢測結腸癌細胞HT-29和SW116細胞表面NMDAR1的表達；應用噻唑藍（MTT）比色法測定62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801對于HT-29和SW116細胞增殖作用的影響；應用流式細胞術檢測2 000 μmol/L的MK801對HT29和SW116細胞凋亡的影響；應用細胞劃痕實驗檢測50 μmol/L MK801對于結腸癌細胞HT-29和SW116遷移能力的影響。結果結腸癌細胞HT-29和SW116均表達NMDAR1，且主要表達于細胞質中；各濃度的MK801對HT-29細胞，以及濃度為500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801對SW116細胞的生長抑制作用具有時間效應關系，24、48及72 h各MK801濃度組對HT-29和SW116細胞的抑制率隨濃度升高整體呈增強趨勢，但抑制率不呈明顯的劑量效應關系；MK801具有促進HT-29和SW116細胞凋亡的作用，且主要表現誘導細胞早期凋亡；MK801可抑制HT-29和SW116細胞遷移。結論NMDAR1在結腸癌細胞胞質中表達，且NMDAR1拮抗劑MK801具有抑制腫瘤細胞生長、遷移，促進其早期凋亡的作用，有望成為新一代抗腫瘤藥物。

結腸腫瘤；細胞增殖；細胞凋亡；細胞運動；體外研究；N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型1；MK801；HT-29；SW116

腦腸肽是指在胃腸道和神經系統雙重分布的肽類［1］。谷氨酸是哺乳動物中樞神經系統主要的興奮性氨基酸,谷氨酸受體可分為離子型受體和G蛋白偶聯的代謝型受體兩大類［2］。N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartate，NMDA）受體（NMDAR）為主要的離子型受體，其由NR1、NR2和NR3等亞基組成。NR1是NMDAR1的功能部分,構成離子通道［3］。近年來，越來越多的研究表明，NMDAR不僅在神經系統發育、疼痛感覺等中發揮著重要的作用,而且也參與了胃腸道組織細胞的增殖，被視為一種腦腸肽［4］。研究顯示，NMDAR拮抗劑能抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導腫瘤細胞的凋亡［5］。然而，有關NMDAR及其拮抗劑對于結腸癌作用的報道較少。MK801為非選擇性NMDAR1拮抗劑，本文通過分析MK801對于結腸癌細胞HT-29及SW116增殖、凋亡、遷移作用的影響，探討MK801用于結腸癌治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器人結腸癌細胞株HT-29、SW116（中科院基礎研究所，上海），MK801（MCE公司，美國），胎牛血清、DMEM培養基（Hyclone公司，美國），McCOY 5a培養基（吉諾生物醫藥技術有限公司），胰蛋白酶-EDTA消化液、噻唑藍（MTT，Solarbio公司，中國），Rabbit Anti-NMDAR1、超敏二步法免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），流式檢測凋亡試劑盒AnnexinV-FITC Apoptosis DetectionKit I（BD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人結腸癌HT-29細胞用McCOY 5a培養基，SW116細胞用DMEM培養基。培養基中均加入10%胎牛血清，同時加入100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素，接種至細胞培養瓶后，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 免疫組織化學法檢測HT-29及SW116細胞表面NMDAR1的表達分別取對數生長期的HT-29和SW116細胞分別接種于24孔板，每種細胞均分為實驗組和對照組，培養24 h待細胞貼壁后，吸棄培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞2次，5 min/次，加入4%多聚甲醛固定15 min，吸棄，PBS洗3次；加入0.3%的TritanX-100細胞打孔，室溫10 min，吸棄，PBS洗3次；加入3%H2O210 min以滅活內源性酶，吸棄，PBS洗3次；加入5%BSA室溫封閉30 min，吸棄。實驗組加入NMDAR1抗體，4℃孵育過夜。對照組用PBS代替NMDAR1抗體。次日吸棄，PBS洗3次；加入二抗孵育30 min，吸棄，PBS洗4次；加入DAB試劑顯色5 min，PBS終止，流水沖10 min，蘇木精染核30 s，流水沖洗，1%乙醇鹽酸返藍，流水沖10 min，依次過體積分數85%、90%、95%、100%乙醇，二甲苯2次脫水，封片膠封片。顯微鏡下觀察細胞染色情況，以細胞膜及細胞質染色為棕黃色至棕褐色為陽性反應。

1.2.3 MTT比色法檢測MK801對HT-29和SW116細胞生長抑制的影響分別取處于指數生長期的HT-29和SW116細胞用胰酶進行消化,調整細胞濃度為1×105個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，培養24 h后棄去培養基，分別加入用培養基配置的濃度為62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801，以不加藥物處理的細胞為對照組，繼續培養24、48、72 h后，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，并設置空白孔，37℃避光孵育4 h,棄去培養液,每孔加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩15 min，酶標儀檢測波長為492 nm的光密度（OD）值。計算細胞生長抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。本實驗每次設置3個復孔，重復實驗3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測MK801對HT-29和SW116細胞凋亡的影響參照Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。HT-29和SW116細胞經2 000 μmol/L的MK801處理24 h，以未經藥物處理的細胞為對照組，每組收集1×106個細胞，冷PBS洗滌2次，1 000 r/min離心3 min，棄上清液。將細胞重懸于500 μL的1×binding buffer，調整細胞濃度為1×106個/mL，取100 μL細胞置于流式細胞儀專用試管中，加5 μL AnnexinV FITC，避光室溫反應15 min，加入5 μL碘化丙啶（PI）輕輕混勻,再加入400 μL 1×binding buffer，過濾膜，流式細胞儀檢測凋亡情況。實驗重復3次取平均值。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測HT-29和SW116細胞體外遷移能力調整細胞密度為5×106個/mL，以每孔1 mL接種到12孔板上，培養24 h待細胞貼壁后，用10 μL槍頭在孔板中央劃1條寬度均一的劃痕，PBS洗2遍以除去劃下的細胞，加入培養基配置的50 μmol/L的MK801，以不加藥物的培養基為陰性對照，拍照取樣，記錄劃痕的位置。繼續培養48 h，取相同位置拍照取樣，用Pro-Plus軟件計算細胞遷移前后劃痕距離，并計算細胞遷移率=（遷移前距離-遷移后距離）/遷移前距離×100%，實驗重復3次。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，所有計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HT-29及SW116細胞中NMDAR1的表達情況NMDAR1在結腸癌HT-29和SW116細胞中均呈陽性表達，且主要表達于細胞胞質中，表現為細胞質中染色為棕黃色至棕褐色，而對照組僅表現為核染色，見圖1。

2.2 MK801對HT-29及SW116細胞的生長抑制作用（1）組內隨時間變化：除對照組外，各MK801濃度組對HT-29細胞的生長抑制率隨時間延長呈增強趨勢，而SW116細胞僅500.0、1 000.0及2 000.0 μmol/L組細胞生長抑制率隨時間延長呈增強趨勢，細胞生長抑制率具有時間效應關系（P＜0.01），見表1、2。（2）各時點組間比較：24、48及72 h各MK801濃度組對HT-29和SW116細胞的生長抑制率隨濃度升高整體呈增強趨勢，但組間多重比較差異并非全部有統計學意義，抑制率不呈明顯的劑量效應關系，見表1、2。

Tab.1The inhibitory effects of MK801 on the growth of HT-29 cells表1 MK801對HT-29細胞生長抑制的作用（n=3,%，）

Tab.1The inhibitory effects of MK801 on the growth of HT-29 cells表1 MK801對HT-29細胞生長抑制的作用（n=3,%，）

＊＊P＜0.01，a～f分別表示與對照組、62.5、125.0、250.0、500.0及1 000.0 μmol/L組比較，P＜0.05；A、B分別表示與24、48 h組比較，P＜0.05，表2同

組別對照組實驗組（μmol/L）62.5 125.0 250.0 500.0 1 000.0 2 000.0 F 24 h 0 48 h 0 72 h 0 F 8.40±3.30 24.58±1.66a 37.83±10.12ab 45.36±6.99abcd 75.60±2.74abcde 84.57±1.55abcdef 122.43＊＊27.09±6.30aA 49.29±7.44abA 69.77±3.65abA 89.02±1.22abcdA 90.55±1.35abcdeA 95.68±0.27abcdeA 248.55＊＊46.11±2.29aAB 72.75±0.26abAB 90.88±0.61abcAB 97.03±0.37abcdA 97.79±0.59abcdAB 98.83±0.25abcdAB 4 579.51＊＊57.15＊＊89.71＊＊55.28＊＊137.76＊＊118.54＊＊197.88＊＊

Tab.2The inhibitory effects of MK801 on the growth of SW116 cells表2 MK801對SW116細胞生長抑制的影響（n=3,%，）

Tab.2The inhibitory effects of MK801 on the growth of SW116 cells表2 MK801對SW116細胞生長抑制的影響（n=3,%，）

組別對照組實驗組（μmol/L）62.5 125.0 250.0 500.0 1 000.0 2 000.0 F 24 h 0 48 h 0 72 h 0 F 4.28±0.76a 13.83±2.05ab 18.91±1.42abc 24.58±2.14abcd 49.09±2.34abcde 78.58±1.08abcdef 901.58＊＊7.81±3.49a 12.97±3.56a 23.16±2.67abc 50.60±2.42abcdA 66.32±4.73abcdeA 79.41±1.64abcdefA 321.24＊＊6.76±1.90a 10.97±2.63a 23.04±2.26abc 45.33±2.88abcAB 80.79±1.66abcdeAB 84.36±1.56abcdeAB 885.579＊＊1.80 0.81 3.68 90.86＊＊73.95＊＊73.95＊＊

2.3 MK801對HT-29和SW116細胞凋亡的影響HT-29和SW116細胞中，實驗組凋亡率均明顯高于對照組（P＜0.01），且主要為早期凋亡，見圖2、表3。

Fig.2The effects of MK801 on apoptotic rates of HT-29 and SW116 cells detected by Annexin V/propidium iodide staining圖2 MK801對結腸癌HT-29、SW116細胞凋亡的影響

Tab.3Effects of MK801 on apoptosis and migration of HT-29 and SW116 cells表3 MK801對HT-29和SW116細胞凋亡和遷移能力的影響（n=3,%，）

Tab.3Effects of MK801 on apoptosis and migration of HT-29 and SW116 cells表3 MK801對HT-29和SW116細胞凋亡和遷移能力的影響（n=3,%，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

遷移率51.92±1.78 37.59±2.79 7.48＊＊組別對照組實驗組t HT-29凋亡率2.80±0.20 65.67±0.81 129.83＊＊SW116凋亡率1.80±0.20 53.56±0.77 111.78＊＊遷移率25.25±2.77 15.14±3.19 4.14＊

2.4 MK801對HT-29細胞和SW116細胞遷移能力的影響HT-29細胞及SW116細胞中，實驗組的遷移率均低于對照組（P＜0.05），見表3、圖3。

Fig.3Effects of MK801 on migration of HT-29 and SW116 cells（×100）圖3 MK801對HT-29和SW116細胞遷移能力的影響（×100）

3 討論

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，美國2016年的癌癥數據顯示，結直腸癌在癌癥發病率中位列第4，在癌癥導致的死亡率中位于第2［6］。研究顯示，在我國結直腸癌平均每年新發病例可達37.6萬例，占全部惡性腫瘤發病的8.7%，居第5位；每年死于該病的患者有19.1萬例，占由癌癥導致死亡人數的6.7%，居第5位［7］。雖然伴隨著分子生物技術的發展，對于結直腸癌的手術、化療、放療及分子靶向治療方面取得了很大進展，但晚期患者由于發生多處轉移，治愈率仍較低［8-9］。

NMDAR是興奮性神經遞質谷氨酸的離子型受體,主要存在于中樞神經系統中［1］。既往研究表明，NMDAR抑制劑對于腫瘤細胞具有抑制作用［10］；而在消化道腫瘤的研究中，Watanabe等［11］研究表明，NMDAR可在胃癌細胞中表達，并且NMDAR拮抗劑能抑制胃癌細胞的增殖。Kim等［12］研究認為NMDAR拮抗劑能抑制食管癌的增殖。

本研究細胞免疫組織化學結果顯示，HT-29細胞及SW116細胞胞質染色為棕黃色至棕褐色，表明結腸癌HT-29細胞及SW116細胞胞質中表達NMDAR1。細胞增殖實驗顯示，各濃度的MK801對HT-29細胞，以及濃度為500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801對SW116細胞的生長抑制作用具有時間效應關系，24、48及72 h各MK801濃度組對HT-29和SW116細胞的抑制率隨濃度升高整體呈增強趨勢，但抑制率不呈明顯的劑量效應關系。細胞凋亡實驗顯示，實驗組的凋亡率明顯高于對照組，且主要表現為誘導細胞早期凋亡。細胞遷移實驗顯示，HT-29細胞及SW116細胞中，實驗組的遷移率均低于對照組，表明MK801可抑制細胞遷移。該結果與Watanabe等［11］、Kim等［12］的研究結果相符。

另有研究認為，高濃度的Ca2+能促進腫瘤細胞的增殖，對于腫瘤細胞分化至關重要，而Ca2+對腫瘤細胞的形成過程也起著重要作用，并且影響細胞遷移［13］。本研究結果表明，NMDAR1在腫瘤細胞胞質中表達，并且NMDAR1拮抗劑MK801能抑制細胞的增殖、遷移，并促進細胞早期凋亡，而NMDAR1抑制劑的作用機制主要是通過抵抗細胞內的Ca2+濃度，從而降低腫瘤細胞Ca2+濃度，起到抑制細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡的作用，因此，筆者認為MK801對腫瘤細胞的作用機制可能與Ca2+通道或Ca2+調節酶有關。

綜上所述，谷氨酸離子型受體NMDAR1不僅在神經系統中表達，在外周組織細胞中亦有表達，可視為一種腦腸肽［1］，而NMDAR1拮抗劑MK801對腫瘤細胞具有生長抑制作用，且可抑制腫瘤細胞遷移，并促進細胞早期凋亡，故其可能成為新一代的抗腫瘤藥物，為臨床治療提供新途徑。

（圖1見插頁）

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（2016-06-14收稿2016-07-13修回）

（本文編輯陸榮展）

Effects of MK801 on proliferation,apoptosis and migration of colorectal cancer cells

XIE Dongbing1,MENG Jianyu2,GUO Yuting3Δ,REN Xia4,LI Xue1
1 The Second Clinical College of Shandong University of TCM,Jinan 250014,China;2 The Institute of Technology of Shandong University of TCM;3 Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Shandong University of TCM;4 The Academy of Medical Science of Shandong Province△

ObjectiveTo explore the expression of the N-methyl-D-aspartate receptor type 1(NMDAR1)in the colorectal cancer cells(CRC),and to examine the effects of NMDAR1 antagonists MK801 on proliferation,apoptosis and migration of colorectal cancer cell line HT-29 and SW116 cells.MethodsThe immunocytochemistry method was used to examine the expressions of NMDAR1 in HT-29 and SW116 cells.MTT assay was used to detect the effects of MK801(62.5, 125.0,250.0,500.0,1 000.0,2 000.0 μmol/L)on the proliferation of HT-29 and SW116 cells.The flow cytometry was used to analyze the effect of MK801(2 000 μmol/L)on cell apoptosis of HT-29 and SW116 cells.Wound healing assay was used to detect the effect of MK801(50 μmol/L)on the migration of HT-29 or SW116 cells.ResultsThe NMDAR1 was expressed in both HT-29 and SW116 cells,and mainly in the cytoplasm.MTT assay showed that there were inhibitory effects of different concentrations of MK 801(62.5,125.0,250.0,500.0,1 000.0,2 000.0 μmol/L)on the proliferation of HT-29 cells,and inhibitory effects of different concentrations of MK801(500.0,1 000.0,2 000.0 μmol/L)on SW116 cells,in a time-dependent manner.For 24,48 and 72 h,the inhibitory effects of MK801 on proliferation rates of HT-29 and SW116 cells were increased with the increased concentrations of MK801.MK801 showed an effect to induce cell apoptosis in HT-29 and SW116 cells,and mainly for early apoptosis.Wound healing assay indicated that MK801 inhibited the cell migration of HT-29 and SW116 cells.ConclusionResults suggest that there is expression of NMDAR1 in colorectal cancer cells. The NMDAR1 antagonist MK801 can inhibit the proliferation,induce cells early apoptosis and inhibit cells migration.It maybe a new generation of antitumor drugs.

colonic neoplasms；cell proliferation；apoptosis；cell movement；in vitro；N-methyl-D-aspartate receptor subtype 1；MK801；HT-29；SW116

R735.35

A

10.11958/20160486

山東省自然科學基金資助項目（Y2008C141）

1山東中醫藥大學第二臨床學院（郵編250014）；2山東中醫藥大學理工學院；3山東中醫藥大學附屬第二醫院消化科；4山東省醫學科學院基礎所

謝冬冰（1990），女，碩士在讀，主要從事消化道疾病診治的研究

Δ通訊作者E-mail:zhmqlw@sina.com