甘草酸二銨干預兔基底動脈瘤形成的實驗研究

桂錚，汪子文，張鵬飛，趙文可，于耀宇

甘草酸二銨干預兔基底動脈瘤形成的實驗研究

桂錚，汪子文，張鵬飛，趙文可，于耀宇△

目的探討甘草酸二銨（DG）干預兔基底動脈瘤發生的作用機制。方法新西蘭白兔40只，按照隨機數字表法分為對照組、動脈瘤（IA）組、生理鹽水（NS）組、DG組，每組10只。其中對照組不做任何處理，其余各組結扎雙側頸總動脈建立基底動脈瘤形成模型。在造模后的第1～7天，IA組不做處理，DG組給予DG［20 mg/（kg·d）］靜脈注射，NS組注入等劑量生理鹽水。使用免疫組化染色方法檢測基底動脈尖核轉錄因子核因子kappa B（NF-κB）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）表達情況，使用免疫熒光染色方法檢測基底動脈尖α-平滑肌細胞肌動蛋白（α-SMA）表達情況。結果IA組和NS組NF-κB和MMP-9表達均高于對照組，α-SMA表達量低于對照組（P＜0.05）；IA組和NS組差異無統計學意義（P＞0.05）。DG組NF-κB和MMP-9表達低于IA組和NS組（P＜0.05），而α-SMA表達量高于IA組和NS組（P＜0.05）。結論DG可抑制NF-κB和MMP-9的表達，減輕血管壁內炎癥反應，抑制顱內動脈瘤的形成。

顱內動脈瘤；炎癥；NF-κB；基質金屬蛋白酶9；肌動蛋白類；血管壁破壞性重構

顱內動脈瘤（intracranial aneurysm,IA）是顱內血管管壁的異常膨出，是一種嚴重的致死性疾病。其形成的機制尚未完全闡明，目前研究表明，血流動力學引發內皮細胞破壞性重塑并誘發炎癥反應可能是引起該病的重要途徑［1］。結扎雙側頸總動脈制作兔基底動脈瘤起始模型排除了血流動力學因素以外其他因素的干擾，適用于顱內動脈瘤發生過程分子機制的研究。本研究即采用該模型，并經耳緣靜脈注射甘草酸二銨（DG），觀察DG對兔基底動脈尖動脈瘤發生過程的干預效果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料清潔級新西蘭白兔40只，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，雌雄不分，體質量2.0～2.5 kg。DG注射液（連云港正大天晴）。一抗：兔抗兔轉錄因子核因子kappa B（NF-κB）p65抗體（Abcam，ab90532），小鼠抗兔基質金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體（Abcam，ab58803），小鼠抗兔α-平滑肌細胞肌動蛋白（α-SMA）抗體（Abcam，ab7817）。熒光二抗：羅丹明標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋，ZF0313），SP-9000免疫組化試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模實驗動物按照隨機數字表法分為4組：對照組、動脈瘤（IA）組、生理鹽水（NS）組、DG組，每組10只。對照組不做任何處理，其余各組結扎雙側頸總動脈建立基底動脈瘤形成模型。造模時肌內注射速眠新Ⅱ0.2 mL，后耳緣靜脈注射2.5%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉。麻醉后將動物固定，頸部備皮，行頸部正中切口，分別分離雙側頸總動脈后用4-0絲線結扎。縫合皮膚及軟組織。實驗動物造模后第1～7天，IA組不做處理，DG組給予DG 20 mg/（kg·d）靜脈注射，NS組注入等量生理鹽水。

1.2.2 實驗動物取材造模后第7天時過量麻醉處死動物，斷頭取腦，固定，修剪組織，制作基底動脈尖部組織蠟塊，脫水包埋制備基底動脈尖部血管縱切面玻片。

1.2.3 基底動脈尖NF-κB和MMP-9免疫組化染色組織玻片常規脫蠟至水，3%H2O2溶液孵育后高壓熱修復，用山羊血清孵育，加兔抗兔NF-κB p65（1∶200）或小鼠抗兔MMP-9（1∶500），4℃過夜。按照試劑盒說明書進行二抗孵育及DAB顯色。常規蘇木素復染、鹽酸乙醇分化液分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后在200倍鏡下觀察并計算NF-κB和MMP-9陽性表達細胞百分比。

1.2.4 基底動脈尖α-SMA免疫熒光染色組織玻片常規脫蠟至水，0.1%Triton-100TM破膜后高壓熱修復，用山羊血清孵育，加入小鼠抗兔α-SMA（1∶200），4℃過夜。避光加入山羊抗小鼠IgG（1∶100），室溫孵育后避光加入DAPI（1∶100），孵育后用50%碳酸甘油緩沖液封片，在Leica DMI 3000B熒光顯微鏡下觀察，計算α-SMA陽性表達面積百分比（陽性表達面積/管壁區域面積）。

1.3 統計學方法應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基底動脈尖NF-κB、MMP-9的免疫組化結果與對照組相比，IA組和NS組NF-κB和MMP-9表達均增高（P＜0.05）；IA組和NS組差異無統計學意義（P＞0.05）。與NS組和IA組相比，DG組兩指標表達均下降（P＜0.05）。見表1，圖1、2。

Tab.1Comparison of NF-κB,MMP-9 and α-SMA expressions between four groups表1 各組NF-κB和MMP-9陽性表達細胞百分比和α-SMA陽性表達面積百分比比較（n=10，%，）

Tab.1Comparison of NF-κB,MMP-9 and α-SMA expressions between four groups表1 各組NF-κB和MMP-9陽性表達細胞百分比和α-SMA陽性表達面積百分比比較（n=10，%，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與IA組比較，c與NS組比較，P＜0.05

NF-κB 10.47±1.92 20.20±3.16a 21.71±6.52a 14.66±3.65bc 15.427＊＊組別對照組IA組NS組DG組F MMP-9 18.20±3.29 29.42±6.56a 31.95±7.26a 22.62±4.19bc 12.743＊＊α-SMA 80.03±3.44 60.42±12.00a 57.25±9.01a 70.67±4.97bc 16.328＊＊

2.2 基底動脈尖α-SMA免疫熒光染色結果與對照組相比，IA組和NS組α-SMA表達均下降（P＜0.05）；IA組和NS組差異無統計學意義（P＞0.05）。與NS組和IA組相比，DG組α-SMA表達增高（P＜0.05）。見表1、圖3。

3 討論

3.1 顱內動脈瘤起始模型可行性分析結扎兔雙側頸總動脈法是制作顱內動脈瘤動物模型的經典方法之一，該方法最早由Hassler報道［2］。Meng等［3］采用相同方法對20只新西蘭白兔進行處理，27周后存活的17只全部出現基底動脈尖部以內彈力層損傷、動脈中層變薄以及管壁向外膨出為特點的破壞性重塑，這些特點也是顱內動脈瘤血管管壁的特征性改變。Mandelbaum等［4］和Metaxa等［5］研究也得出同樣的特征性改變，可見使用該方法制作兔基底動脈瘤形成模型切實有效，且該模型適用于顱內動脈瘤發生階段病理機制的研究。本研究中，使用該方法同樣在7 d后出現兔基底動脈尖部血管壁的損傷，證明該模型可行且有效。

3.2 NF-κB、MMP-9等在顱內動脈瘤形成過程中的作用炎癥反應是顱內動脈瘤形成的重要環節，NF-κB介導的炎癥通路尤為重要［6］。顱內動脈瘤形成過程中血流動力學的變化可引起內皮細胞NF-κB激活［7］。單核細胞趨化因子（MCP）-1、MMPs、白細胞介素（IL）-1β等表達增多也與NF-κB的激活有關［8］。本研究中，結扎兔雙側頸總動脈改變了基底動脈尖部的血流動力學狀況，結扎7 d后，IA組和NS組NF-κB表達量明顯增高，該結果與Aoki等［9］研究結果一致。血流動力學變化引起NF-κB激活的途徑很多，如環氧化酶2（COX-2）-NF-κB正反饋機制［10］等。本研究中，IA組和NS組MMP-9表達也增高，MMP-9升高可能與PI3K/Akt/NF-κB通路激活有關［11］。動脈瘤組織中大量表達的MMP-9可降解細胞外基質（ECM）。ECM是維持管壁細胞穩態的重要成分，大量ECM降解可引起管壁結構損傷，造成管壁薄弱。維持顱內動脈管壁的強度和形態的另一種成分是收縮表型平滑肌細胞，而α-SMA是收縮表型平滑肌細胞的重要標志。本研究中，IA組和NS組α-SMA表達低于對照組，說明收縮表型平滑肌細胞含量降低，即平滑肌細胞出現凋亡或表型轉化。平滑肌細胞表型轉化主要由腫瘤壞死因子（TNF）-α和Kruppel樣因子-4（KLF-4）進行調控［12］，而NF-κB則可以影響這兩種分子的表達。

3.3 DG對顱內動脈瘤形成的干預作用DG是中藥單體，分子式C42H68N2O16，相對分子質量為857.01。DG具有廣泛的抗炎作用，目前主要用于肝病的治療。DG可通過多種途徑抑制NF-κB的轉錄、表達以及激活［13-14］。本研究中，DG組NF-κB和MMP-9的表達低于IA組和NS組，說明DG可抑制基底動脈尖部NF-κB的表達或激活。NF-κB表達受抑制后，受NF-κB調控的MMP-9表達也出現降低。NF-κB和MMP-9表達的降低可以減輕基底動脈尖部炎癥反應的發生以及ECM的降解，從而減輕管壁結構受損的程度。此外，DG組α-SMA的表達高于IA組和NS組，說明DG組平滑肌細胞的凋亡或表型轉化比例較少，大量存在的收縮表型平滑肌細胞使血管壁強度和形態得以維持?？傊?，DG可以通過抑制NF-κB介導的炎癥通路，降低MMP-9的表達以及平滑肌細胞凋亡或表型轉化的數量，減輕顱內動脈管壁的炎癥反應和損傷程度，達到干預顱內動脈瘤形成的目的。

（圖1～3見插頁）

［1］Turjman AS，Turjman F，Edelman ER.Role of fluid dynamics and inflammation in intracranial aneurysm formation［J］.Circulation，2014，129（3）：373-382.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.113. 001444.

［2］Hassler O.Experimental carotid ligation followed by aneurysmal formation and other morphological changes in the circle of Willis［J］.J Neurosurg，1963，20：1-7.doi:10.3171/jns.1963.20.1.0001.

［3］Meng H，Metaxa E，Gao L，et al.Progressive aneurysm development following hemodynamic insult［J］.J Neurosurg，2011，114（4）：1095-1103.doi:10.3171/2010.9.JNS10368.

［4］Mandelbaum M，Kolega J，Dolan JM，et al.A critical role for proinflammatory behavior of smooth muscle cells in hemodynamic initiation of intracranial aneurysm［J］.PLoS One，2013，8（9）：e74357.doi:10.1371/journal.pone.0074357.

［5］Metaxa E，Tremmel M，Natarajan SK，et al.Characterization of critical hemodynamics contributing to aneurysmal remodeling at the basilar terminus in a rabbit model［J］.Stroke，2010，41（8）：1774-1782.doi:10.1161/STROKEAHA.110.585992.

［6］Cheng WT，Wang N.Correlation between MMP-2 and NF-κ B expression of intracranial aneurysm［J］.Asian Pac J Trop Med，2013，6（7）：570-573.doi:10.1016/S1995-7645（13）60098-X.

［7］Li M，Tan Y，Stenmark KR，et al.High pulsatility flow induces acute endothelial inflammation through overpolarizing cells to activate NF-κB［J］.Cardiovasc Eng Technol，2013，4（1）：26-38. doi:10.1007/s13239-012-0115-5.

［8］Sadamasa N，Nozaki K，Hashimoto N.Disruption of gene for inducible nitric oxide synthase reduces progression of cerebral aneurysms［J］.Stroke，2003，34（12）：2980-2984.doi:10.1161/01. STR.0000102556.55600.3B.

［9］Aoki T，Kataoka H，Shimamura M，et al.NF-κB is a key mediator of cerebral aneurysm formation［J］.Circulation，2007，116（24）：2830-2840.doi:10.1161/Circulationaha.107.728303.

［10］Aoki T，Nishimura M，Matsuoka T，et al.PGE2-EP2 signalling in endothelium is activated by haemodynamic stress and induces cerebral aneurysm through an amplifying loop via NF-κB［J］.Br J Pharmacol，2011，163（6）：1237-1249.doi:10.1111/j.1476-5381.2011.01358.x.

［11］Chen S，Chen W，Zhang X，et al.Overexpression of KiSS-1 reduces colorectal cancer cell invasion by downregulating MMP-9 via blocking PI3K/Akt/NF-κB signal pathway［J］.Int J Oncol，2016，48（4）：1391-1398.doi:10.3892/ijo.2016.3368.

［12］Ali MS，Starke RM，Jabbour PM，et al.TNF-α induces phenotypic modulation in cerebral vascular smooth muscle cells：implications for cerebral aneurysm pathology［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（10）：1564-1573.doi:10.1038/jcbfm.2013.109.

［13］Cherng JM，Lin HJ，Hung MS，et al.Inhibition of nuclear factor kappaB is associated with neuroprotective effects of glycyrrhizic acid on glutamate-induced excitotoxicity in primary neurons［J］. Eur J Pharmacol，2006，547（1/3）：10-21.doi:10.1016/j. ejphar.2006.06.080.

［14］Xiong H，Xu Y，Tan G，et al.Glycyrrhizin ameliorates imiquimodinduced psoriasis-like skin lesions in BALB/c mice and inhibits TNF-α-induced ICAM-1 expression via NF-κB/MAPK in HaCaT cells［J］.Cell Physiol Biochem，2015，35（4）：1335-1346.doi: 10.1159/000373955.

（2016-03-07收稿2016-08-26修回）

（本文編輯李鵬）

The intervention effect of diammonium glycyrrhizinate on the formation of basilar artery aneurysm in rabbits

GUI Zheng,WANG Ziwen,ZHANG Pengfei,ZHAO Wenke,YU Yaoyu△
Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital,Logistics College,Armed Police Command,Tianjin 300162,China△

ObjectiveTo explore the mechanism and intervention effects of diammonium glycyrrhizinate(DG)on the formation of intracranial aneurysm(IA)in rabbits.MethodsForty New Zealand rabbits were randomly divided into four groups:control group,IA group,normal saline(NS)groupandDG group,10rabbits for eachgroup. Except for the control group,rabbits in other three groups were operated with bilateral common carotid artery ligation to produce basilar artery aneurysm formation model.DG group was injected intravenously with DG［20 mg/(kg·d)］from the first day to the seventh day after operation,NS group was given same volume of normal saline,while IA group was injected nothing.The expressions of NF-κB and MMP-9 were detected by immunohistochemical staining,while α-SMA was stained with immunofluorescence.ResultsThe expressions of NF-κB and MMP-9 were significantly higher in IA group and NS group than those of control group,while α-SMA expression was significantly lower than that of control group (P＜0.01).There were no significant differences in expressions of NF-κB and MMP-9 between IA group and NS group(P＞0.05).The expressions of NF-κB and MMP-9 were significantly lower in DG group than those of IA group and NS group(P＜0.05).The expression of α-SMA was significantly higher in DG group than that of IA group and NS group(P＜0.05). ConclusionDG can downregulate the expression levels of NF-κB and MMP-9 in intracranial aneurysm,suppress inflammatory in artery wall and reduce the pathological changes and have intervention effect on intracranial aneurysm formation.

intracranial aneurysm;inflammation;NF-kappa B;matrix metalloproteinase 9;actins;destructive remodeling of vascular wall

R743.9

A

10.11958/20160102

武警后勤學院附屬醫院基金重點項目（FYZ201507）

武警后勤學院附屬醫院神經外科（郵編300162）

桂錚（1989），男，碩士，初級職稱，主要從事神經介入臨床及基礎研究

△通訊作者E-mail：yuyaoyu666@aliyun.com