O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯的合成與生物活性

譚效松,朱國中,賀紅武

(華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

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O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯的合成與生物活性

譚效松,朱國中,賀紅武

(華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

丙酮酸脫氫酶系(PDHc)屬于焦磷酸硫胺素(TPP)依賴性酶，是一個(gè)具有重要農(nóng)學(xué)意義的農(nóng)藥作用靶標(biāo)。以微生物中的丙酮酸脫羧酶E1(PDHc E1)為靶標(biāo),設(shè)計(jì)合成TPP類似物有望發(fā)現(xiàn)新型的殺菌活性化合物。以三唑環(huán)代替TPP結(jié)構(gòu)中的噻唑環(huán)，以異硫氰酸酯結(jié)構(gòu)單元替代TPP結(jié)構(gòu)中的焦磷酸結(jié)構(gòu)單元，設(shè)計(jì)合成了O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯類系列化合物Ⅰa～Ⅰj，采用IR、1HNMR、MS和元素分析對(duì)Ⅰa～Ⅰj進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，部分化合物還經(jīng)13CNMR進(jìn)一步進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，此類化合物不僅為大腸桿菌丙酮酸脫羧酶E1(PDHc E1)的抑制劑,而且還顯示了殺菌活性。

丙酮酸脫羧酶；焦磷酸硫胺素；氨基硫代甲酸酯；生物活性

根據(jù)生物化學(xué)原理,丙酮酸脫氫酶系(pyruvatedehydrogenasecomplex,PDHc)是一個(gè)具有重要農(nóng)學(xué)意義的農(nóng)藥作用靶標(biāo)[1]。PDHc屬于焦磷酸硫胺素(thiaminepyrophosphate,TPP)依賴性酶，也稱丙酮酸脫氫酶復(fù)合體，主要由3種酶組成：丙酮酸脫羧酶E1(PDHcE1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶E2以及二氫硫辛酸脫氫酶E3，在微生物、哺乳動(dòng)物以及高等植物中廣泛存在。在PDHc的催化下，丙酮酸發(fā)生不可逆的氧化脫羧反應(yīng)生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A再進(jìn)入三羧酸循環(huán)被徹底氧化，為生物體供給大量能量[2-3]。因此，該步驟是連接糖的酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在生物體代謝中起著極其關(guān)鍵的作用，一直以來都是醫(yī)藥及農(nóng)藥研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[4]。在PDHc催化的5步反應(yīng)中，由PDHcE1催化的第一步反應(yīng)是唯一的不可逆步驟，因此，以微生物中的PDHcE1為靶標(biāo)設(shè)計(jì)新型的殺菌劑具有很高的探索價(jià)值。在此催化反應(yīng)中，TPP作為PDHc的輔因子與PDHcE1結(jié)合，促使丙酮酸氧化脫羧產(chǎn)生羥乙基TPP負(fù)碳離子。因此，TPP在該不可逆過程中起著至關(guān)重要的作用，如果沒有TPP的參與，該反應(yīng)步驟則不能順利完成，進(jìn)而整個(gè)丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)被阻斷，這也就意味著整個(gè)生物體不能利用糖的有氧代謝為機(jī)體提供必需的能量，從而導(dǎo)致生物體死亡。因此，通過設(shè)計(jì)合成以微生物的PDHcE1為靶標(biāo)的TPP類似物抑制劑,有望發(fā)現(xiàn)新型的殺菌活性化合物[5-9]。鑒于此，作者對(duì)TPP結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造和修飾,考慮到TPP結(jié)構(gòu)中焦磷酸部分電荷高，很難穿透細(xì)胞膜，而含有異硫氰酸酯亞結(jié)構(gòu)的化合物很多都具有良好的殺菌活性，將其引入替代TPP結(jié)構(gòu)中的焦磷酸結(jié)構(gòu)單元，同時(shí),為了便于合成,以三唑環(huán)代替了TPP結(jié)構(gòu)中的噻唑環(huán),從而設(shè)計(jì)合成了新型O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯類系列化合物Ⅰa～Ⅰj，并對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征,測(cè)定了目標(biāo)化合物對(duì)大腸桿菌PDHcE1和6種常見作物病菌的抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

三乙胺、氯化亞砜、炔丙醇、VB1、疊氮化鈉、取代苯甲酸、硫氰化鉀、檸檬酸、無水硫酸鈉、亞硫酸鈉、碘化亞銅、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙腈、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺。以上試劑均為分析純。

德國Heidilph MR3001型磁力攪拌器；SHZ-D型循環(huán)水真空泵，鞏義英裕予華儀器廠；德國BuchiRotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AVATAR 360型傅立葉紅外光譜儀；Varian XL-400M型核磁共振譜儀；Finnigen TRACE MS型質(zhì)譜儀；Vario EL Ⅲ型元素分析儀；WRS-IB型熔點(diǎn)儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 2-甲基-4-氨基-5-疊氮甲基嘧啶(Ⅲ)的合成[10]

向裝有100 mL水的圓底燒瓶中依次加入VB1(Ⅱ，10.3 g,30.6 mmol)、疊氮化鈉(4.9 g,75.4 mmol)和亞硫酸鈉(0.38 g,3.0 mmol)，混合物在65 ℃下反應(yīng)5 h；然后加入檸檬酸(21.0 g,100 mmol )調(diào)節(jié)溶液pH值約為4，用二氯甲烷萃取，棄去有機(jī)層；向水層加入碳酸鉀至溶液pH值約為8，析出白色固體，即為2-甲基-4-氨基-5-疊氮甲基嘧啶(Ⅲ)，收率65%，m.p.150～153 ℃。

1.2.2 取代苯甲酰氯(Ⅴ)的合成[11]

向干燥三頸瓶中加入0.03 mol取代苯甲酸(Ⅳ)和4 mL氯化亞砜，同時(shí)滴入1～2滴DMF，加熱至65～70 ℃，回流反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸出反應(yīng)剩余的氯化亞砜，得取代苯甲酰氯(Ⅴ)粗產(chǎn)品(淡黃色液體)，收率87%～94%，直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.3 取代苯甲酰基異硫氰酸酯(Ⅵ)的合成[11]

向干燥三頸瓶中加入0.03 mol硫氰化鉀和25 mL無水乙腈,冷卻至10 ℃以下。將0.03 mol取代苯甲酰氯(Ⅴ)溶于10 mL無水乙腈，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴入三頸瓶中，滴畢，室溫下攪拌20 min，再加熱至85 ℃，回流反應(yīng)1.5 h，冷卻至室溫，加入三乙胺調(diào)節(jié)溶液的pH值約為7，抽濾，除去反應(yīng)生成的氯化鈉固體，將濾液脫溶即得取代苯甲酰基異硫氰酸酯(Ⅵ)粗產(chǎn)品(橙色液體)，收率90%以上，直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.4 取代苯甲酰基氨基硫代甲酸炔丙酯(Ⅷ)的合成[12]

向干燥三頸瓶中加入0.03 mol炔丙醇(Ⅶ)、0.015 mol三乙胺及15 mL無水乙腈，冷卻至10 ℃以下。將0.025 mol取代苯甲酰基異硫氰酸酯(Ⅵ)溶于10 mL無水乙腈，通過恒壓滴液漏斗緩慢滴入三頸瓶中，滴畢，室溫下攪拌12～24 h，薄層層析法(TLC)跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液各洗滌一次至溶液呈中性，再用15 mL的二氯甲烷萃取水相3次，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，抽濾，脫溶即得粗產(chǎn)品。經(jīng)硅膠G柱層析純化，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(1∶3，體積比)。純品為無色或淡黃色液體，收率62%～75%。

1.2.5 目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj的合成[10]

向干燥圓底燒瓶中加入0.01 mol 2-甲基-4-氨基-5-疊氮甲基嘧啶(Ⅲ)、0.01 mol取代苯甲酰基氨基硫代甲酸炔丙酯(Ⅷ)、0.01 mol三乙胺及10 mL無水四氫呋喃，室溫?cái)嚢?0 min，待圓底燒瓶中所有固體全部溶解后，向其中加入1.6 mg碘化亞銅，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12～24 h。反應(yīng)完畢，緩慢加入50 mL水，繼續(xù)攪拌，待溶液中出現(xiàn)大量黃色固體。抽濾，水沖洗，所得固體即為粗產(chǎn)品。將所得粗產(chǎn)品用DMF和水重結(jié)晶，得到Ⅰa～Ⅰj淡黃色固體，收率70%～88%。

Ⅰa～Ⅰj,R:H、2-Cl、3-Cl、4-Cl、2-CH3、4-CH3、2-F、4-F、2-Br、2，6-F2

1.2.6 PDHc E1抑制活性測(cè)試

在100 μL測(cè)活體系中加入0.2 mmol·L-1TPP、0.4 mmol·L-1DCIP、50 mmol·L-1K3PO4(pH=6.4)、5μg PDHc E1(Cx-ace)和100μmol·L-1的待測(cè)化合物(對(duì)照組加入等量的溶劑DMSO)。先不加底物，在恒溫箱中37 ℃下溫育3 min，讓酶與其它反應(yīng)試劑充分結(jié)合，然后加入2 mmol·L-1底物開啟反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)600 nm處吸光度，0 min時(shí)測(cè)一次OD0min，在酶標(biāo)儀中37 ℃反應(yīng)5 min后，再測(cè)OD5min，最后求吸光度的差值△OD=OD0min-OD5min，每組實(shí)驗(yàn)做平行3～5個(gè)。按下式計(jì)算酶抑制率：

1.2.7 殺菌活性測(cè)試

以菌絲的生長(zhǎng)速率為依據(jù)來測(cè)定殺菌活性。選取水稻紋枯病、黃瓜灰霉病、小麥赤霉病、番茄早疫病、煙草赤星病和黃瓜炭疽病作為供試靶標(biāo)。目標(biāo)化合物用少許丙酮溶解，吐溫-80乳化，加入蒸餾水配成一定濃度溶液待用。取馬鈴薯20g、葡萄糖15g、瓊脂15g和水1 000mL配成培養(yǎng)基后，與直徑9cm的培養(yǎng)皿高溫減壓滅菌25min；趁熱將13.5mL培養(yǎng)基和1.5mL藥液混合均勻等分到兩個(gè)培養(yǎng)皿中，水平放置，冷卻；用滅過菌的取菌器分別從培養(yǎng)液中取5mm帶菌瓊脂，放入各培養(yǎng)皿中(菌絲面向下)，每皿放2～3種菌。設(shè)兩組空白對(duì)照，然后置于無菌恒溫干燥箱內(nèi)48h，測(cè)定菌斑的直徑。以不加目標(biāo)化合物為空白對(duì)照，按下式計(jì)算抑菌率：

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)表征

采用IR、1HNMR、MS等手段對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，部分化合物還采用13CNMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)采用元素分析進(jìn)一步確定目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)。目標(biāo)化合物的理化常數(shù)及結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：

Ⅰa：淺黃色固體，收率88%，m.p.120～122 ℃。 IR(KBr)，ν，cm-1:3 512,3 150,1 702,1 606,1 440,1 277;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.35(s,2H,-CH2-),5.44(s,2H,-CH2-),5.66(s,2H,-NH2),7.41～8.03(m,5H,phenyl-H),7.72(s,1H,-C=CH-),8.19(s,1H,-CH=N-);13CNMR(400 MHz,DMSO-d6)，δ：25.2,46.9,57.9,108.2,125.0,128.8, 129.2,133.5,142.0,156.4,156.4,161.6,165.5,167.2,179.3;MS(ESI)，m/z:384[M+H]+;Anal.Calcd for C17H17N7O2S (383.03):C53.25,H 4.47,N 25.57,S 8.36,Found:C 53.09,H 4.74,N 25.33,S 8.04。

Ⅰb：黃色固體，收率87%，m.p.115～116 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 544,3 145,1 717,1 606,1 441,1 265;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.50(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.45(s,2H,-CH2-),5.58(s,2H,-NH2),7.28～7.85(m,4H,phenyl-H),7.46(s,1H,-C=CH-),8.19(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:418[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16ClN7O2S(417.39):C 48.86，H 3.86，Cl 8.48，N 23.46，S 7.67，F(xiàn)ound:C 48.83，H 4.20，N 23.57，S 7.82。

Ⅰc：黃色固體，收率84%，m.p.139～141 ℃。 IR(KBr)，ν，cm-1:3 454,3 147,1 722,1 599，1 441,1 270;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.38(s,2H,-CH2-),5.44(s,2H,-CH2-),5.66(s,2H,-NH2),7.35～7.99(m,4H,phenyl-H),7.72(s,1H,-C=CH-),8.05(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:418[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16ClN7O2S(417.39):C 48.86，H 3.86，Cl 8.48，N 23.46，S 7.67，F(xiàn)ound:C 49.24，H 3.96，N 23.53，S 7.74。

Ⅰd：黃色固體，收率78%，m.p.124～125 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 452,3 110,1 708,1 601,1 441,1 277);1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.43(s,2H,-CH2-),5.63(s,2H,-NH2),7.39～7.97(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);13CNMR(400 MHz,DMSO-d6)，δ：25.2,46.8,58.1,108.2,125.0,128.1,131.0,138.4,141.7,156.3,161.5,164.6,167.6,180.3;MS(ESI)，m/z:418[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16ClN7O2S (417.39):C 48.86，H 3.86，Cl 8.48，N 23.46，S 7.67，F(xiàn)ound:C 49.02，H 4.05，N 23.33，S 7.75。

Ⅰe：淺黃色固體，收率73%，m.p.156～157 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 512,3 150,1 702,1 616,1 441,1 270;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),2.62(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.41(s,2H,-CH2-),5.67(s,2H,-NH2),7.22～7.96(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:398[M+H]+;Anal.Calcd for C18H19N7O2S(397.21):C 54.39，H 4.82，N 24.67，S 8.07，F(xiàn)ound:C 54.69，H 4.99，N 24.65，S 7.62.

Ⅰf：黃色固體，收率83%，m.p.123～125 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 452,3 118,1 709,1 600,1 441,1 253;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.51(s,3H,-CH3),2.65(s,3H,-CH3),5.38(s,2H,-CH2-),5.43(s,2H,-CH2-),5.54(s,2H,-NH2),7.32～7.93(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.08(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:398[M+H]+;Anal.Calcd for C18H19N7O2S(397.21):C 54.39，H 4.82，N 24.67，S 8.07，F(xiàn)ound:C 54.17，H 4.73，N 23.55，S 8.01。

Ⅰg：淺黃色固體，收率71%,m.p.146～148 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 453,3 148,1 729,1 606,1 441,1 253;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.46(s,2H,-CH2-),5.60(s,2H,-NH2),7.11～7.93(m,4H,phenyl-H),7.52(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:402[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16FN7O2S(401.35):C 50.87，H 4.02，N 24.43，S 7.99，F(xiàn)ound:C 51.04，H 4.29，N 24.32，S 7.66。

Ⅰh：黃色固體，收率76%，m.p.132～133 ℃。 IR(KBr)，ν，cm-1:3 454,3 111,1 721,1 606,1 441，1 253;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.50(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.43(s,2H,-CH2-),5.62(s,2H,-NH2),7.07～8.06(m,4H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI) ，m/z:398[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16FN7O2S(401.35):C 50.87，H 4.02，N 24.43，S 7.99，F(xiàn)ound:C 50.92，H 4.34，N 24.40，S 7.80。

Ⅰi：黃色固體，收率70%，m.p.134～136 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 453,3 145,1 721,1 606,1 441,1 270;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.50(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.45(s,2H,-CH2-),5.61(s,2H,-NH2),7.33～7.80(m,4H,phenyl-H),7.66(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:463[M+H]+;Anal.Calcd for C17H16BrN7O2S(462.47):C 44.16，H 3.49，N 21.21，S 6.94，F(xiàn)ound:C 44.44，H 3.77，N 21.38，S 6.84。

Ⅰj：黃色固體，收率77%，m.p.141～142 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1:3 440,3 139,1 725,1 566,1 441,1 265;1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：2.49(s,3H,-CH3),5.36(s,2H,-CH2-),5.42(s,2H,-CH2-),5.59(s,2H,-NH2),6.92～7.71(m,3H,phenyl-H),7.71(s,1H,-C=CH-),8.20(s,1H,-CH=N-);MS(ESI)，m/z:420[M+H]+;Anal.Calcd for C17H15F2N7O2S(462.36):C 48.68，H 3.60，F(xiàn) 9.06，N 23.38，S 7.65，F(xiàn)ound:C 48.32，H 3.86，N 23.62，S 7.54。

2.2 合成反應(yīng)條件的探討

在制備取代苯甲酰氯時(shí)SOCl2既作原料又作溶劑，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)減壓蒸餾除盡過量的SOCl2，若SOCl2殘余量過多，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)制備取代苯甲酰基異硫氰酸酯的反應(yīng)失敗。

在三乙胺的催化下，炔丙醇與取代苯甲酰基異硫氰酸酯發(fā)生親核加成反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)相對(duì)溫和，為保證反應(yīng)的順利進(jìn)行，原料炔丙醇、取代苯甲酰基異硫氰酸酯和反應(yīng)溶劑乙腈必須干燥無水，否則將降低產(chǎn)物的收率和純度；采用炔丙醇稍過量的配比(炔丙醇∶苯甲酰基異硫氰酸酯=1.2∶1，物質(zhì)的量比)更有利于反應(yīng)完全和產(chǎn)物的分離；取代苯甲酰基異硫氰酸酯在強(qiáng)堿及高溫條件下易分解，因此需選用弱堿三乙胺(或吡啶)作為反應(yīng)的催化劑，在滴加取代苯甲酰基異硫氰酸酯時(shí)，需控制反應(yīng)體系的溫度在10 ℃以下。

目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj的合成利用了點(diǎn)擊化學(xué)的原理。關(guān)于利用點(diǎn)擊化學(xué)原理構(gòu)建三唑環(huán)的合成方法，文獻(xiàn)報(bào)道主要包括以下兩類：(1)以無水硫酸銅、抗壞血酸鈉為催化劑，以水和叔丁醇為反應(yīng)溶劑；(2)以碘化亞銅和三乙胺為催化劑，以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑。對(duì)兩種方法均進(jìn)行了嘗試，其中方法(1)中，抗壞血酸鈉具有很強(qiáng)的還原性，且不是很穩(wěn)定，保存不便；方法(2)具有操作簡(jiǎn)單、無副產(chǎn)物及收率高的特點(diǎn)。因此，采用方法(2)合成，利用點(diǎn)擊化學(xué)的原理在分子骨架中引入三唑環(huán)結(jié)構(gòu)單元，成功合成了目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj。

2.3 生物活性

2.3.1 目標(biāo)化合物對(duì)大腸肝菌PDHc E1的抑制活性

作者所在實(shí)驗(yàn)室通過長(zhǎng)期、系統(tǒng)的研究，采用基因克隆的方法從大腸桿菌中表達(dá)并純化獲得了純的PDHc E1，建立了化合物對(duì)PDHc E1抑制活性的篩選體系。為了考察所設(shè)計(jì)合成的目標(biāo)化合物是否為PDHc E1靶酶的抑制劑,首先在100μmol·L-1濃度下測(cè)試目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj對(duì)大腸桿菌PDHc E1的抑制活性，并計(jì)算IC50值，結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj對(duì)大腸桿菌PDHc E1的抑制活性

由表1可知，目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj對(duì)大腸桿菌PDHc E1具有顯著的抑制活性，有7個(gè)目標(biāo)化合物在100μmol·L-1濃度下對(duì)大腸桿菌PDHc E1的抑制率達(dá)到98%～100%。特別是目標(biāo)化合物Ⅰf和Ⅰj的抑制活性最高，其IC50值小于10μmol·L-1，分別為8μmol·L-1和7μmol·L-1。

總結(jié)目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj的構(gòu)效關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Ⅰa～Ⅰj分子中苯環(huán)上取代基R的種類和位置對(duì)大腸桿菌PDHc E1的抑制活性具有下列影響：

(1)當(dāng)苯環(huán)上2-位和6-位同時(shí)被強(qiáng)吸電子基F取代時(shí)，化合物具有最高的酶抑制活性。化合物Ⅰj(R=2,6-F2)對(duì)大腸桿菌PDHc E1的IC50值為7μmol·L-1。

(2)當(dāng)苯環(huán)上為單取代時(shí)，取代基的位置對(duì)化合物酶抑制活性的影響為：4-位取代的化合物的酶抑制活性優(yōu)于2-位和3-位取代的化合物，如化合物Ⅰd(R=4-Cl)、Ⅰc(R=3-Cl)和Ⅰb(R=2-Cl)對(duì)大腸桿菌PDHc E1的IC50值分別為10μmol·L-1、11μmol·L-1和12μmol·L-1。其它化合物也有同樣的構(gòu)效關(guān)系。

(3)當(dāng)苯環(huán)上4-位被單取代時(shí)，取代基為推電子基時(shí)優(yōu)于吸電子基化合物的酶抑制活性。如化合物Ⅰf(4-CH3)、Ⅰd(R=4-Cl)和Ⅰh(R=4-F)對(duì)大腸桿菌PDHc E1的IC50值分別為8μmol·L-1、10μmol·L-1和14μmol·L-1。

2.3.2 目標(biāo)化合物對(duì)常見農(nóng)作物病菌的殺菌活性

為了考察目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj的殺菌活性，選取6種農(nóng)作物的常見病菌：水稻紋枯病(Rhizoctoniasolani)、黃瓜灰霉病(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病(Fusariumgraminearum)、番茄早疫病(Alternariasolani)、煙草赤星病(Alternariaalternata)和黃瓜炭疽病(Colletotrichumorbiculare) 作為測(cè)試靶標(biāo)，在100 mg·L-1的濃度下，對(duì)目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj的殺菌活性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表2所示。

表2 目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj的殺菌活性

由表2可知，在100 mg·L-1的濃度下，目標(biāo)化合物對(duì)黃瓜灰霉病、煙草赤星病和黃瓜炭疽病的殺菌活性較為突出，而對(duì)小麥赤霉病、水稻紋枯病和番茄早疫病的殺菌活性較差。目標(biāo)化合物的殺菌活性總體上低于對(duì)照藥劑苯醚甲環(huán)唑。

目標(biāo)化合物Ⅰa～Ⅰj分子中苯環(huán)上取代基R的種類和位置對(duì)殺菌活性具有下列影響：

(1)當(dāng)苯環(huán)上2-位和6-位同時(shí)被強(qiáng)吸電子基F取代時(shí)，化合物具有最高的殺菌活性，如化合物Ⅰj(R=2,6-F2)對(duì)水稻紋枯病的抑菌率達(dá)到91%，與苯醚甲環(huán)唑相當(dāng)。

(2)當(dāng)苯環(huán)上為單取代時(shí)，取代基的位置對(duì)化合物殺菌活性的影響為：4-位取代化合物的殺菌活性優(yōu)于2-位和3-位取代的化合物，如化合物Ⅰh(R=4-F)、Ⅰc(R=3-Cl)和Ⅰg(R=2-F)對(duì)黃瓜灰霉病的抑菌率分別為73%、54%和32%。

(3)當(dāng)苯環(huán)上R為4-位單取代時(shí)，取代基種類對(duì)化合物殺菌活性的影響為：當(dāng)4-位取代基為推電子基時(shí)，相應(yīng)化合物的殺菌活性優(yōu)于4-位為吸電子基時(shí)對(duì)應(yīng)的化合物，如化合物Ⅰf(4-CH3)、Ⅰa(R=H)和Ⅰd(4-Cl)對(duì)黃瓜炭疽病的抑制率分別為74%、72%和30%。

比較目標(biāo)化合物對(duì)大腸桿菌PDHc E1的抑制活性和殺菌活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)二者之間的構(gòu)效關(guān)系基本一致,化合物對(duì)大腸桿菌PDHc E1的抑制活性順序與化合物的殺菌活性順序具有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。如Ⅰf和Ⅰj的IC50值分別為8μmol·L-1和7μmol·L-1,是該系列中酶抑制活性最高的化合物，并且它們也是該系列中殺菌活性最高的化合物。

3 結(jié)論

根據(jù)生物化學(xué)原理,以PDHc E1為靶標(biāo)，通過設(shè)計(jì)輔酶TPP類似物來獲得PDHc E1抑制劑，以期發(fā)現(xiàn)具有殺菌活性的化合物。對(duì)輔酶TPP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理改造，以三氮唑替代TPP結(jié)構(gòu)中的噻唑環(huán)，同時(shí)以具有良好殺菌活性的苯甲酰基異硫氰酸酯結(jié)構(gòu)單元替代TPP結(jié)構(gòu)中的焦磷酸部分，設(shè)計(jì)合成了10個(gè)新型的TPP類似物,即O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯類化合物，所有目標(biāo)化合物經(jīng)1HNMR、IR、MS和元素分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和確認(rèn)，部分化合物還經(jīng)13CNMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。測(cè)試了目標(biāo)化合物對(duì)大腸桿菌PDHc E1的抑制活性和對(duì)常見農(nóng)作物病菌水稻紋枯病、黃瓜灰霉病、小麥赤霉病、番茄早疫病、煙草赤星病和黃瓜炭疽病的殺菌活性，結(jié)果表明此類化合物不僅對(duì)大腸桿菌PDHc E1具有顯著的抑制活性,部分化合物還顯示了明顯的殺菌活性。目標(biāo)化合物的酶抑制活性和殺菌活性之間存在相關(guān)性，表明作者的設(shè)計(jì)思想是合理可行的。

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Synthesis and Biological Activity ofO-[1-(2-methyl-4-aminopyrimidine-5-methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl] methyl benzoylcarbamothioates

TAN Xiao-song,ZHU Guo-zhong，HE Hong-wu

(KeyLaboratoryofPesticide&ChemicalBiology,MinistryofEducation，CollegeofChemistry,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China)

Pyruvatedehydrogenasecomplex(PDHc)whichbelongstothiaminepyrophosphate(TPP)-dependentenzymeisanimportanttargetforthedevelopmentofnewpesticide.ThedesignandsynthesisofTPPanalogsareexpectedtofindnewantifungalactivecompoundswhichtargetpyruvatedecarboxylaseE1(PDHcE1)inmicroorganism.AseriesofnewO-[1-(2-methyl-4-aminopyrimidine-5-methyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)]methylbenzoylcarbamothioatesⅠa～Ⅰjweredesignedandsynthesizedbyintroducingtriazoleringinsteadofthiazolering,andisothiocyanatestructuralunitreplacingpyrophosphateinthestructureofTPP.TargetcompoundswerecharacterizedbyIR,1HNMR,MSandconfirmedbyelementalanalysis.Somecompoundswerealsocharacterizedby13CNMRspectra.TheresultsshowedthatcompoundsⅠa～ⅠjweredemonstratedtobeEscherichia coliPDHcE1inhibitorsandsomecompoundsexhibitedantifungalactivitybythebioassay.

pyruvatedecarboxylaseE1(PDHcE1);thiaminepyrophosphate(TPP);carbamothioate;biologicalactivity

國家973計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010CB126100)，國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20772042)

2016-09-18

譚效松(1962-)，男，副教授，主要從事農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)與性質(zhì)研究；通訊作者：賀紅武，教授，E-mail:he1208@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.001

譚效松,朱國中,賀紅武.O-[1-(2-甲基-4-氨基嘧啶-5-甲基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基]甲基取代苯甲酰氨基硫代甲酸酯的合成與生物活性[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(11)：1-7.

O 627.42

A

1672-5425(2016)11-0001-07