納米二氧化鈦皮膚暴露對小鼠腦和血管的毒性研究

郭 晴，劉志敏，李瀟瀟，趙 云，沈世平，蔡 潔，袁均林，楊 旭，李 睿

(華中師范大學生命科學學院 湖北省遺傳調控和整合生物學重點實驗室，湖北 武漢 430079)

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納米二氧化鈦皮膚暴露對小鼠腦和血管的毒性研究

郭 晴，劉志敏，李瀟瀟，趙 云，沈世平，蔡 潔，袁均林，楊 旭，李 睿

(華中師范大學生命科學學院 湖北省遺傳調控和整合生物學重點實驗室，湖北 武漢 430079)

為研究納米二氧化鈦(nano-TiO2)對小鼠腦和血管的毒性，將56只小鼠隨機分為8組，每組7只，分別為control、solvent control、4 mg·kg-1nano-TiO2、20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2、500 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1維生素E(VE)+100 mg·kg-1nano-TiO2和100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2，采用皮膚涂抹的方式，對小鼠進行連續42 d暴露。結果表明：4 mg·kg-1nano-TiO2和20 mg·kg-1nano-TiO2對小鼠的大腦毒性和血管損傷較低，100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2對小鼠的大腦毒性和血管損傷明顯，暴露中VE的添加對nano-TiO2給腦和血管造成的損傷具有一定的緩解作用。初步證明nano-TiO2皮膚暴露在一定劑量下可對小鼠腦和血管引起毒性作用，其原因可能為氧化損傷。

納米二氧化鈦；毒性；小鼠；皮膚暴露

隨著納米技術的發展，越來越多的納米材料應用到藥載系統、抗菌材料、化妝品以及電子產品中[1-2]。TiO2是一種常見的納米材料，具有極強的催化能力、較小的尺寸[3]以及紫外吸收[4]等特點，被作為防曬霜中的一種保護成分。隨著防曬霜的使用越來越普遍，TiO2對人體的安全性問題逐漸引起了研究者的關注。有研究者認為TiO2不能穿過完整的皮膚屏障。如Sadrieh等[5]將微米級TiO2、納米級TiO2以及用氫氧化鋁和二甲聚乙烷聚合物修飾過的nano-TiO2，以2mgcream/cm2的濃度涂抹于小型豬的皮膚上，結果表明nano-TiO2顆粒不能穿過完整的表皮。但是也有研究證明nano-TiO2可以穿過皮膚。如人的包皮被移植到嚴重聯合免疫缺陷小鼠上，利用透射電子顯微鏡和質子激發X熒光光譜分析法，觀察到nano-TiO2顆粒可進入到達皮膚的角質層[6]。Wu等[7]將nano-TiO2暴露于離體的豬皮24h，結果表明nano-TiO2沒有穿過皮膚的角質層；但是將nano-TiO2涂抹到活體豬耳朵上30d，發現nano-TiO2可以穿過豬的角質層，且最終分布到較深的表皮層；此外將nano-TiO2顆粒涂抹于裸小鼠的皮膚上，nano-TiO2可穿過皮膚進入不同的組織，并可引起一些組織損傷。這些結果表明nano-TiO2長時間暴露于人的皮膚，有可能對人體造成損傷。

納米顆粒可以通過各種途徑進入血液進而到達各個組織器官[8]。Liu等[9]研究表明，nano-TiO2通過腹腔注射后可以經血液循環進入大腦。Hu等[10]利用灌胃方式將nano-TiO2暴露于小鼠，結果表明nano-TiO2長期低劑量的暴露，有可能對小鼠大腦造成損傷。此外，nano-TiO2還可以通過呼吸系統進入大腦[11]。因此，化妝品中的nano-TiO2是否會穿過皮膚經血液循環進入大腦，對人的血管系統和大腦造成危害值得探討。作者采用皮膚涂抹的方式將nano-TiO2暴露于小鼠42d，探究nano-TiO2對小鼠腦和血管的影響。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

無特定病原體(specific pathogen free,SPF)雌性BALB/c小鼠,湖北省預防醫學科學院動物實驗中心。

nano-TiO2(白色粉末，含量85%～90%)，江蘇河海納米科技股份有限公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、硫代巴比妥酸(TBA)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，Sigma-Aldrich公司；維生素E(VE)，國藥集團化學試劑有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天公司；小鼠血栓調節蛋白酶聯免疫吸附檢測試劑盒、小鼠可溶性細胞粘附因子1酶聯免疫吸附檢測試劑盒、小鼠D-二聚體酶聯免疫吸附試劑盒，上海藍基生物科技有限公司；小鼠IL-4酶聯免疫吸附檢測試劑盒、小鼠IFN-γ酶聯免疫吸附檢測試劑盒、小鼠IgE酶聯免疫吸附檢測試劑盒，eBioscience公司。

Eppendorf 5415R型低溫冷凍離心機，Beckman公司；-20 ℃冰箱、玻璃勻漿器，廣東科龍公司；-80 ℃超低溫冰箱，日本Sanyo公司；ML-902型定時恒溫磁力攪拌器，上海浦江分析儀器廠；FLx800型熒光酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司；JN-3200DT型超聲處理器，寧波江南儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 染毒方式

56只6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分為8組，每組7只，分別為control、solvent control、4 mg·kg-1nano-TiO2、20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2、500 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2和100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2。分組之后先進行一周的實驗室環境飼養，然后每天對小鼠進行脫毛處理。按0.01 mL·(g體重)-1對小鼠進行皮膚涂抹染毒，染毒周期為42 d。nano-TiO2用溶劑進行配制，實驗前用超聲處理器進行超聲分散，VE用生理鹽水配制，染毒期間小鼠均可自由進水進食。

1.2.2 腦組織樣品制備

第42 d染完毒24 h后，先對小鼠進行心臟取血，然后取出腦置于冰上，按10 mL·g-1添加PBS溶液(pH=7.5)。使用玻璃勻漿器配制成腦組織勻漿。將腦組織勻漿在4 ℃、10 000 r·min-1的條件下離心10 min，收集上清液置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 活性氧簇(ROS)含量的測定

ROS含量采用DCFH-DA[12]法進行檢測。DCFH-DA本身不具備熒光特征，但其可進入細胞，在胞內被水解產生DCFH，DCFH可與胞內的ROS發生反應，被氧化生成DCF，DCF具有熒光特征，其熒光強弱將間接地反映細胞內ROS含量的多少。

實驗步驟如下：用PBS溶液(pH=7.5)將勻漿上清液稀釋100倍；用排槍取100 μL稀釋液加入酶標板中；加入100 μL熒光染料染色，避光反應20 min;利用熒光酶標儀測出485 nm激發光、525 nm發射光下的熒光強度。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定

采用TBA法測定MDA的含量[13]。MDA能夠與TBA反應縮合形成紅色產物，通過吸光值的測定可以計算出MDA的含量。

實驗步驟如下：取500 μL勻漿上清液于試管中，加入2 mL 0.6 % TBA，沸水浴15 min；取1 mL 上清液于EP管中，100 000×g離心5 min；取100 μL上清液于酶標板中；用酶標儀測出532 nm、600 nm和450 nm波長處的吸光值，按照下式計算MDA的含量(μmoL·g-1)：MDA含量 = 6.45× (OD532-OD600)-0.56×OD450。

1.2.5 谷胱甘肽(GSH)含量的測定

采用DTNB法測定GSH含量[14]。DTNB可以在黑暗的條件下與GSH反應形成黃色化合物TNB。

實驗步驟如下：取200 μL勻漿上清液，加入1 mL有機溶劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，用渦旋儀混合均勻，在冰上靜置10 min后，100 000×g離心5 min；在不破壞蛋白層的情況下，取上清液50 μL加入酶標板，加150 μL濃度為60 ng·mL-1的DTNB，室溫下避光反應5 min；用酶標儀測出412 nm波長處的吸光值。

1.2.6 腦組織IL-4和IFN-γ含量的測定

實驗原理：采用雙抗夾心法ELISA來檢測抗原。將純化的抗小鼠IL-4和IFN-γ(一抗)預先包被在酶標板每個微孔底部，使其充分吸附在固相載體上，加入待測樣品或標準品，待測物質與抗體結合后，加入酶標二抗，待二抗與待測物質結合后，加入酶反應底物，充分顯色后終止反應，通過檢測吸光值繪制標準曲線，計算出樣品中待測物質的含量。

取勻漿上清液測定其中IL-4和IFN-γ的含量，按照成品ELISA試劑盒步驟完成測定內容。

1.2.7 血清中TM、sICAM-1、D2D和Ig-E含量的測定

實驗原理同1.2.6。

取勻漿上清液測定其中TM、sICAM-1、D2D和Ig-E的含量，按照成品ELISA試劑盒步驟完成測定內容。

1.3 統計分析

數據采用Origin 6.1統計軟件進行t檢驗處理，比較暴露組與對照組測量值的差異：P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。利用Prism進行作圖。

2 結果與討論

2.1 nano-TiO2的形態特征(圖1)

圖1 nano-TiO2的掃描電子顯微鏡(SEM)照片

由圖1可知，nano-TiO2在SEM下呈片層結構，粒徑約為15～40 nm，表面光滑。本防曬劑用nano-TiO2對可見光具有很高的透過性，對紫外線有很好的阻隔作用，廣泛適用于美白潤膚露、美白面霜、防曬霜等化妝品中。

2.2 nano-TiO2暴露后小鼠腦組織氧化應激指標的測定(圖2)

圖2 nano-TiO2暴露后小鼠腦組織氧化應激指標的測定

由圖2a可知，小鼠腦組織中ROS含量隨nano-TiO2暴露量的增加逐漸升高，與對照組相比，4 mg·kg-1nano-TiO2暴露組ROS含量顯著升高 (P<0.05)，20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的ROS含量分別出現極顯著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，ROS含量出現顯著性下降(P<0.05)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，ROS含量出現極顯著性下降(P<0.01)。

由圖2b可知，小鼠腦組織中GSH含量隨nano-TiO2暴露量的增加逐漸降低，與對照組相比，100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組GSH含量顯著降低 (P<0.05)，500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組GSH含量極顯著降低 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與相應的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，GSH含量都呈升高的趨勢，但是無統計學意義。

由圖2c可知，小鼠腦組織中MDA含量隨nano-TiO2暴露量的增加逐漸升高，與對照組相比，100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的MDA含量顯著升高 (P<0.05)；500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的MDA含量極顯著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與相應的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，小鼠腦組織中MDA含量都呈下降趨勢，但是無統計學意義。

2.3 nano-TiO2暴露后小鼠腦組織炎癥指標的測定(圖3)

圖3 nano-TiO2暴露后小鼠腦組織炎癥指標的測定

由圖3a可知，與對照組相比，100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的IL-4含量均極顯著升高 (P<0.01);100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與相應的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，小鼠腦組織IL-4含量均出現顯著性降低(P<0.05)。

由圖3b可知，與對照組相比，500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的IFN-γ含量顯著升高 (P<0.05)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與相應的100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，小鼠腦組織中IFN-γ含量雖有一定程度的升高，但是無統計學意義。

2.4 nano-TiO2暴露后小鼠血清中Ig-E、D2D、sICAM-1和TM含量的測定(圖4)

由圖4a可知，與對照組相比，20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的Ig-E含量均極顯著升高 (P<0.01);100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，Ig-E含量呈顯著性下降(P<0.05)；而100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，Ig-E含量呈下降趨勢，但是無統計學意義。

由圖4b可知，與對照組相比，100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的D2D含量均極顯著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，D2D含量呈顯著性下降(P<0.05)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，D2D含量呈極顯著性下降(P<0.01)。

圖4 nano-TiO2暴露后小鼠血清中Ig-E、D2D、sICAM-1和TM的含量

由圖4c可知，與對照組相比，4 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的sICAM-1含量顯著升高 (P<0.05)，20 mg·kg-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的sICAM-1含量均極顯著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與相應的500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組、100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，sICAM-1含量都呈下降趨勢，但是無統計學意義。

由圖4d可知，與對照組相比，4 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的TM含量顯著升高 (P<0.05)，20 mL·g-1nano-TiO2、100 mg·kg-1nano-TiO2和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組的TM含量均極顯著升高 (P<0.01)；100 mg·kg-1VE+500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，TM含量顯著性下降(P<0.05)；而100 mg·kg-1VE+100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組與100 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，TM呈下降趨勢，但是無統計學意義。

2.5 討論

2.5.1 nano-TiO2暴露后對小鼠腦組織的影響

研究表明，納米材料的毒性機制主要是氧化損傷造成的ROS失衡[15-16]。細胞內的ROS增多時抗氧化劑就會清除多余的ROS，當抗氧化劑無法清除多余的ROS時，就會導致ROS在細胞內產出和清除失衡，引起氧化應激反應，造成蛋白質、脂質以及DNA等大分子的損傷[17]。氧化水平可以分為3個層次[18]：低水平的氧化應激會通過機體的自我保護作用來清除多余的ROS，一般不會引起機體的損傷；中水平的氧化應激不會完全清除體內多余的ROS，多余的ROS會造成一些組織損傷；高水平氧化應激會產生炎癥反應，進一步對機體造成損傷。因此，本實驗通過測定小鼠腦組織的ROS、GSH和MDA氧化應激指標以及IL-4和IFN-γ炎癥指標來檢測不同濃度的nano-TiO2通過皮膚涂抹方式對小鼠大腦的影響，結果表明，低劑量(4 mg·kg-1和20 mg·kg-1)的nano-TiO2對小鼠的大腦毒性較弱，只有較高劑量(100 mg·kg-1和500 mg·kg-1)的nano-TiO2才對小鼠的大腦有明顯的影響(圖2和圖3)。

2.5.2 nano-TiO2暴露后對小鼠血管的影響

Ig-E可與血液中的肥大細胞結合，進而對肥大細胞進行調節作用，主要是促使肥大細胞脫顆粒，這些顆粒會對附近的血管有直接作用[19]。比如動脈粥樣硬化患者病變處肥大細胞和Ig-E增加[20]。因此，Ig-E含量的上升說明血管受到一定的損傷。D2D是纖溶酶溶解時產生的交聯纖維蛋白凝塊，D2D含量升高，會導致血栓形成及血管各部位的嚴重出血。研究發現，冠心病患者的D2D含量均高于正常人[21]。sICAM-1是一種重要的表面粘附分子，屬免疫球蛋白超家族，sICAM-1可誘導細胞發生增殖和遷移，激活T淋巴細胞，繼而影響斑塊的穩定性，導致斑塊破裂，直接影響心血管疾病的發生率。研究發現，sICAM-1的含量越低，其心血管疾病發生率越低[22]。TM是一種糖蛋白，存在于血管內皮細胞表面，具有抗凝的作用，TM水平可以反應冠心病患者血管內皮細胞損傷的嚴重程度,許武紅等[23]指出TM是心血管疾病危險因素的標志物。因此，本實驗選用Ig-E、D2D、sICAM-1和TM作為指標來評價nano-TiO2暴露對小鼠血管的影響。

2.5.3 VE對nano-TiO2暴露后小鼠腦和血管的影響

VE具有抗氧化功能，因此本實驗中使用 VE 作為一種保護劑。對100 mg·kg-1和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組添加保護劑VE，與100 mg·kg-1和500 mg·kg-1nano-TiO2暴露組相比，VE可以降低腦組織氧化應激、炎癥反應，并對血管有一定的保護作用。因此，VE對nano-TiO2對腦和血管系統造成的損傷具有一定的緩解作用。

3 結論

利用nano-TiO2對小鼠皮膚涂抹42 d，并使用VE 作為一種保護劑，考察nano-TiO2對小鼠大腦毒性和血管的損傷作用。結果表明，低劑量(4 mg·kg-1和20 mg·kg-1)的nano-TiO2對小鼠的大腦毒性和血管損傷較低，較高劑量(100 mg·kg-1和500 mg·kg-1)的nano-TiO2才對小鼠的大腦毒性和血管損傷明顯，VE對nano-TiO2對腦和血管系統造成的損傷具有一定的緩解作用,證明nano-TiO2對心腦血管的毒性作用至少部分來源于氧化損傷。因此，長期暴露nano-TiO2有可能對人體造成損害，后續還需進一步研究長期暴露nano-TiO2對小鼠大腦和血管的影響，以充分地對化妝品中的nano-TiO2的安全性進行評估。

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The Toxicity of Nano-TiO2on Brain and Blood Vessel of Mice by Dermal Exposure

GUO Qing，LIU Zhi-min，LI Xiao-xiao,ZHAO Yun，SHEN Shi-ping，CAI Jie，YUAN Jun-lin，YANG Xu，LI Rui

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,CollegeofLifeScience,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China)

Toinvestigatetoxiceffectsofnano-TiO2onbrainandbloodvesselofmice,56BALB/cmicewererandomlydividedinto8groups,includingcontrol,solventcontrol,4mg·kg-1nano-TiO2,20mg·kg-1nano-TiO2,100mg·kg-1nano-TiO2,500mg·kg-1nano-TiO2,100mg·kg-1VE+100mg·kg-1nano-TiO2and100mg·kg-1VE+500mg·kg-1nano-TiO2,with7miceineachgroup.Micewerecontinuouslyexposedtonano-TiO2bydermalexposurefor42days.Theresultsshowedthat,thebrainandbloodvesselofmicein4mg·kg-1nano-TiO2and20mg·kg-1nano-TiO2groupswereslightlydamaged,whileobviouslydamagedin100mg·kg-1nano-TiO2and500mg·kg-1nano-TiO2groups，andvitaminEcouldrelievethatinjurytoacertainextent.Thisstudyshowednano-TiO2hadtoxiceffectsonbrainandbloodofmicebydermalexposureatadoseofnano-TiO2andoxidativedamagemightbeoneofthereasons.

nano-TiO2；toxicity；mice；dermalexposure

國家自然科學基金重點項目(21577045)

2016-07-02

郭晴(1989-),女,河南南陽人,碩士研究生,研究方向：生物化學與分子生物學,E-mail:295100071@qq.com;通訊作者：李睿，副教授,E-mail:ruili@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.11.003

郭晴，劉志敏，李瀟瀟，等.納米二氧化鈦皮膚暴露對小鼠腦和血管的毒性研究[J].化學與生物工程，2016，33(11)：15-20,26.

R 114

A

1672-5425(2016)11-0015-06