三個道地產區丹參混合提取物對大鼠腦缺血再灌注后bc1-2、bax表達的影響*

李紅剛 王紅鴿 聶曉楓 孫 陳衛銀 陜西省渭南職業技術學院(渭南714000)

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三個道地產區丹參混合提取物對大鼠腦缺血再灌注后bc1-2、bax表達的影響*

目的：通過觀察四川、山東、河南三個道地產區丹參混合提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織bc1-2和bax蛋白表達的影響，探討三產區丹參對神經細胞凋亡的影響。方法：采用頸內動脈線栓加環扎法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，再灌注24h后各組bc1-2和bax蛋白的表達采用免疫組化法檢測。結果：再灌注24h后，模型組腦內損傷區周圍bcl-2的表達明顯增加(P<0.05)，三產區丹參組均能明顯上調bcl-2的表達，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，其中山東丹參組上調的幅度最大，與河南、四川丹參組比較有顯著差異(P<0.05)，河南、四川丹參組比較無顯著差異(P>0.05)；再灌注24h后，模型組腦內損傷區周圍bax的表達顯著增加(P<0.01)，三產區丹參組均能明顯降低bax的表達，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，其中四川丹參組降低的幅度最大，山東丹參組次之，河南丹參組降低的幅度最小，三組比較均有顯著差異(P<0.05)。結論：三個道地產區丹參混合提取物均能通過上調bcl-2表達，降低bax的表達，從而抑制神經細胞凋亡，發揮腦保護作用。不同產區丹參混合提取物對各指標表達影響不同，其原因可能與不同產區丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點不一致有關。

丹參是常用活血化瘀藥，其對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的影響報道較多，但查閱文獻，未見不同產地丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型影響的報道。本研究選取四川、河南、山東三個道地產區丹參混合提取物，旨在觀察不同產區丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織bc1-2、bax表達的影響，從而探討其對神經細胞凋亡的影響。

1 材料和方法 1.1 動 物 健康SD大鼠60只(購于四川大學)，合格證號：scxk(川)-10-2006，雌雄各半，體重275.25±24.28g，清潔級，鼠齡7～8周。

1.2 藥品與試劑 采取四川中江古店、山東沂南、河南方城栽培丹參根10kg，樣品采集后快速運回實驗室，經加工處理后，干燥成藥材，由成都中醫藥大學藥學院提取制成0.4g/ml生藥的供試品溶液。兔抗大鼠bcl-2單克隆抗體、兔抗大鼠bax單克隆抗體 ( 購買自北京博奧森生物技術有限公司)；生物素化羊抗兔IgG抗體(購買自北京中衫金橋生物技術有限公司)。

1.3 造模及分組 大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制備方法，采用頸內動脈線栓加環扎法。將60只大鼠按數字隨機法分為：正常組、假手術組、模型組、四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組，每組10只。正常組：不給予任何干預措施；假手術組：先切開右側頸部皮膚，然后暴露右側頸總動脈分叉，隨后再縫合皮膚，術前5d生理鹽水灌胃，1次/d，術后2h生理鹽水再灌胃1次；模型組：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d生理鹽水灌胃，1次/d，再灌注后2h時生理鹽水再灌胃1次；四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d分別予四川、山東、河南丹參混合提取物灌胃，1次/d，再灌注后2h再灌胃1次。再灌注24h后處死大鼠。根據人與動物用量體表面積換算法計算，實驗中丹參混合提取物的灌胃劑量為6.75ml/kg。

1.4 HE及免疫組織化學檢測方法 病理組織切片標本收集及處理：實驗各組SD大鼠，再灌注后24h灌注取腦并固定，固定72h后做成石蠟切片，每個標本各取1張用于HE染色。應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法進行，一抗為兔抗大鼠bcl-2、bax單克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG抗體,封片后再采用光鏡觀察。陽性細胞計數和統計學分析:免疫組化染色結果拍照后進行半定量分析，并計算陽性細胞的積分光密度值IOD。采用SPSS19.0進行數據統計，采用單因素方差分析比較各組間數據，以P<0.05為差異有統計學意義，以P<0.01為極顯著統計學差異。

2 結 果 2.1 各組腦組織光鏡下的HE染色結果 如圖所示，正常組和假手術組細胞與間質之間界限清楚，細胞核完整，核仁清晰；模型組細胞與間質之間界限不清楚，大部分組織細胞壞死，多數細胞溶解呈空泡狀，可見核固縮和核碎裂；三產區丹參各組腦組織細胞壞死程度較模型組輕，可見少量細胞核固縮及溶解，部分胞質液化。

2.2 免疫組化染色的結果 2.2.1 bcl-2蛋白免疫組化染色的結果:正常組和假手術組腦內bcl-2表達較少，二者無顯著差異；模型組腦內損傷區周圍bcl-2的表達增加，與正常組、假手術組比較P<0.05；三產區丹參組均能明顯上調腦內損傷區周圍bcl-2的表達，與模型組比較P<0.05；山東丹參組上調腦內損傷區bcl-2的幅度最大，與河南、四川丹參組比較有顯著差異P<0.05，河南、四川丹參組比較無顯著差異P>0.05，見表1。免疫組化染色見圖2。

A：正常組；B：假手術組；C：模型組；D：河南丹參組；E：四川丹參組；F：山東丹參組

A：正常組；B：假手術組；C：模型組；D：河南丹參組；E：四川丹參組；F：山東丹參組

表1 各組Bcl-2的IOD值

2.2.2 bax蛋白免疫組化染色結果：正常組、假手術組腦內bax表達較少，二者無顯著差異；模型組腦內損傷區周圍bax的表達顯著增加，與正常組、假手術組比較P<0.01；三產區丹參組均能明顯降低腦內損傷區周圍bax的表達，與模型組比較P<0.01；四川丹參組降低腦內損傷區周圍bax的幅度最大、山東丹參組次之，河南丹參組降低的幅度最小，山東、河南丹參組與四川丹參組相比P<0.01，河南丹參組與山東丹參組相比P<0.05，見表2。免疫組化染色見圖3。

表2 各組Bax的IOD值

A：正常組；B：假手術組；C：模型組；D：四川丹參組；E：山東丹參組；F：河南丹參組

3 討 論 3.1 缺血性腦血管病與活血化瘀 缺血性腦血管病屬于中醫“中風”范疇，對中風病因病機的認識,歷代醫家一般認為不外乎與瘀、虛、火、風、痰有關。其中瘀阻腦絡是卒中的病理基礎[1]，血蓄于腦是卒中病的病理中心，血瘀證候存在中風病各證型和階段之中。所以，活血化瘀是治療中風的基本治法。目前，活血化瘀藥多種制劑已廣泛應用于臨床治療腦血管病[2]，且療效較為滿意，同時對活血化瘀藥治療卒中的機理研究也在不斷深入。

3.2 腦缺血再灌注與細胞凋亡 腦缺血再灌注(Cerebra ischemia and reperfusion，CIR)是指腦缺血一段時間后，再恢復其血液供應的過程。多數研究表明，腦缺血再灌注后腦缺血性的損傷反而會加重。腦缺血再灌注后細胞壞死和細胞凋亡并存，缺血中心區主要是細胞壞死，是不可逆的；而細胞凋亡主要出現在缺血灶周圍區即缺血半暗帶，是可逆的，因此，腦缺血再灌注后神經細胞凋亡已成為研究的熱點。

3.3 三個道地產區丹參活性成分的研究 關于丹參藥材的道地產區，郭寶林等考證[3]歷史上河南、山東、湖北和山西等幾個省都曾被視為丹參的道地產區。近代以來,川產丹參被視為佳品,其在《中國道地藥材》中被列為道地藥材。總結以上文獻記載，丹參道地產區主要有四川、河南、山東、山西及湖北等5個產地。多數研究表明，不同產地丹參中丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大。本研究所選用四川中江古店、山東沂南、河南方城三個道地產區丹參,經成都中醫藥大學嚴鑄云教授等[4-5]測定丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大，與多數文獻報道結果相似。

3.4 三個道地產區丹參混合提取物對bcl-2、bax表達的影響 Bcl-2、bax是目前研究較多的一對凋亡調控基因。Bcl-2基因，即B細胞淋巴瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)，該基因最初在血淋巴細胞中被發現。近年來，多數研究也發現，bcl-2基因是抑制細胞凋亡的重要基因之一，它在腦缺血再灌注損傷中表達，而且起重要作用[6]。Bax是1993年在人前B細胞基因文庫發現的一種基因，其作用與bc1-2相反，可抑制bcl-2的功能。以往的研究也顯示[7-8]，局灶性腦缺血后，bax蛋白表達明顯增加，其能與bcl-2蛋白形成異源二聚體，從而抑制bcl-2的功能，促進細胞凋亡。可見，Bcl-2和bax基因對腦細胞凋亡起重要作用，Bcl-2和bax表達水平的高低與細胞凋亡的嚴重性有直接關系。若bcl-2升高，則抑制細胞凋亡；而bax升高，則促進細胞凋亡。

河南、山東、四川三個道地產區丹參混合提取物均能明顯提高bcl-2表達，降低bax表達，表明三產區丹參混合提取物通過上調bcl-2、下調bax的表達而抑制神經細胞凋亡，從而改善缺血再灌注損傷而發揮腦保護作用。同時發現，三個道地產區丹參混合提取物對bax和bcl-2表達的影響不同，對bax的表達，四川丹參組降低的幅度最大，山東丹參組次之，河南丹參組再次之；對bcl-2的表達，山東丹參組上調的幅度大于河南和四川丹參組，河南和四川丹參組無明顯差異。

綜上，三個道地產區丹參混合提取物均能影響bcl-2、bax的表達，抑制神經細胞凋亡，從而發揮腦保護作用；不同產區丹參混合提取物對各指標表達影響不同，其原因可能與不同產區丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點不一致有關。

[1] 屈 沂．益氣活血通絡湯治療缺血性腦中風療效觀察[J]．陜西中醫，2015，36(7)：818-819．

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[3] 郭寶林,林 生,馮毓秀，等. 丹參主要居群的遺傳關系及道地藥材道地性的研究[J].中草藥,2002,33(12)：1113-1116．

[4] 楊新杰,萬德光,林貴兵，等．丹參脂溶性成分的地域分布特點分析[J]．中草藥，2010，41(5)：809-812.

[5] 楊新杰，萬德光，劉 敏，等．丹參水溶性成分的地域分布特點分析[J]．天然產物研究與開發，2011，23：684-688.

[6] 李新崇，阮立新，黃其川，等．黃連堿對腦缺血/再灌注大鼠的影響及其機制研究[J]．中國臨床藥理學與治療學，2015，20(9)：1004-1007．

[7] 張玉淼，王紅蓮，周宏斌，等．丹參川芎嗪注射液對缺血性腦卒中患者血流變及外周血BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白水平的影響[J]．中藥材，2015，38(9)：2003-2005．

[8] 陳 鋒，陽生光，李建軍，等．血塞通對全腦缺血/再灌注后大鼠海馬回中Bcl-2及Bax的影響[J]．臨床醫學工程，2015，22(11)：1426-1427．

(收稿2016-06-18；修回2016-07-29)

*陜西省渭南職業技術學院課題(WZYY201322)

再灌注 丹參(中藥) 大鼠 腦缺血 細胞凋亡 動物實驗

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.056

△通訊作者：成都中醫藥大學附屬醫院神經內科(成都610072)