禽用DNA疫苗免疫效果增強的策略

衣偉萌　殷光文　黃駒輝　江和基　黃志堅（福建農林大學動物科學學院福建省動物藥物工程實驗室福州350002）

禽用DNA疫苗免疫效果增強的策略

衣偉萌殷光文黃駒輝江和基黃志堅*
（福建農林大學動物科學學院福建省動物藥物工程實驗室福州350002）

對于人和動物的傳染病來說，DNA疫苗免疫是一種很有希望的免疫方式。經過25年的發展，已經上市的核酸疫苗仍屈指可數。禽用核酸疫苗一直是禽類疫苗的研究熱點，文中描述提高核酸疫苗免疫效果的方式：接種途徑，疫苗劑量及首免時間，增加宿主細胞對質粒的攝入，添加免疫增強分子，優化質粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強免疫策略。

核酸疫苗禽類免疫途徑

傳統的禽用滅活疫苗或弱毒疫苗在抵抗禽類疫病方面發揮了重要作用，然而這些疫苗也存在著各種缺點。如制備儲存運輸困難，價格貴，在母源抗體或多種血清型病原共存的情況下不能產生很好的保護；一些活疫苗存在毒力返強的危險；很多疫苗不能區分自然感染和疫苗免疫［1-2］。核酸疫苗可以克服上述傳統疫苗的不足，是一類很有希望的疫苗。核酸疫苗有載體和其表達的病原抗原組成，可以在動物體內產生體液免疫和細胞免疫應答；適于大規模免疫，安全、便宜，可以區分野毒感染；可以在常溫下保存較長時間，儲存運輸方便；球蟲核酸疫苗可以減少抗球蟲藥物的使用，進而減少肉類獸藥殘留［3-4］。

通常核酸疫苗免疫激發的保護性免疫應答效果有限，需要采取一些方法進行改善。需要考慮的方面如下：接種途徑，疫苗劑量以及首免時間，增加宿主細胞對質粒的攝入，添加免疫增強分子，優化質粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強免疫策略。

1　優化接種途徑

大多數情況下，核酸疫苗通過肌肉注射的途徑，盡管沒有人對這種途徑的免疫機理進行解釋，但是一些研究人員進行了對比試驗。對于裸露核酸，肌肉注射被認為是最有效的方式。質粒如果與微粒如聚乳酸-羥基乙酸共聚物或殼聚糖混合肌肉注射，通常比單獨裸質粒注射效果要好。質粒如果通過大腸桿菌攜帶口服免疫，效果也通常優于單獨質粒注射。當質粒被金顆粒包裹通過基因槍皮下注射時，效果要優于肌肉注射［5］。

2　質粒的劑量和加強免疫的影響

多數情況下，研究人員都會告訴免疫的劑量，但是通常都沒有告訴選擇這種劑量的依據。通常選擇的劑量為50～200 ug質粒。有研究人員比較了不同劑量的效果，結果發現肌注劑量通常為25～200 ug［6］。有趣的是，一項研究發現，對于柔嫩艾美耳球蟲，核酸疫苗肌注劑量25～50 ug的效果要好于100～200 ug；另一項針對禽流感病毒的研究發現，50～100 ug免疫劑量的效果要優于250 ug免疫劑量。對于蛋內免疫，40～60 ug通常是比較有效的劑量。口服免疫攜帶核酸疫苗的沙門氏菌，細菌的劑量也非常重要。一項研究發現，1011CFU的攜帶鴨腸炎病毒核酸疫苗的沙門氏菌免疫，效果優于低劑量的免疫。同樣，109CFU的攜帶傳染性法氏囊病病毒或柔嫩艾美耳球蟲核酸疫苗的沙門氏菌免疫，效果優于107或108CFU低劑量的免疫［7］。

通常，一次劑量免疫往往不能激發較好的免疫應答。因此，需要加強免疫。對于禽流感病毒來說，加強免疫可以增加抗體的水平。對于禽巴氏桿菌和傳染性法氏囊病病毒，通常需要一到兩次加強免疫。當然，如果電擊等方式被采用的話，免疫次數可以適當降低［8］。

3　初免雞日齡的影響

因為肉雞一般6周齡上市，所以肉雞最好能夠早點免疫，事實上肉雞什么時候進行核酸免疫沒有固定的標準，免疫日齡從18日齡雞胚到孵化后5周～6周。初免日齡對于激發較好的免疫應答非常重要，一項在禽流感病毒上的研究發現，14日齡首免比1日齡首免要產生更高的抗體反應［9］。有研究人員指出，禽類的先天性免疫在幼齡雞上發育不成熟。但是，7日齡的雞肌肉細胞比14日齡的雞更容易進行質粒轉化。

4　增加宿主細胞對質粒的攝取

在哺乳動物上，注射的裸質粒很快就會被降解，這將降低疫苗的效力。因此，要在核酸疫苗降解之前讓盡可能多的質粒被細胞攝取。在一些研究中，細胞轉染的試劑會和核酸疫苗一起免疫動物，但是免疫效果增加多少并不清楚。

質粒攝取可以被機械地增加，可采用電擊的方式增加質粒進入到細胞中。在禽上，電擊可引起局部炎癥反應，招募CD3+T細胞，增加體液免疫和細胞免疫的強度，而且質粒的濃度可以顯著降到10 ug［10］。

此外，使用基因槍將包裹在金顆粒上的DNA注射到雞的皮內，可以增加保護性免疫應答，質粒的量可降至1～2 ug。目前已有兩種高壓力的液體注射系統AgrojetTM和MedijectorTM被開發和使用［11］。

5　共注射免疫調節因子

免疫調節因子可以增加疫苗的效力。在禽上，共注射免疫調節因子是一種最經常被采用的增強疫苗效力的方法。大部分研究聚焦于雞，少部分研究采用鴨做實驗動物。在雞上，IL2最常被用在核酸疫苗中。IL2可以增加抗體的產生，提高淋巴細胞的增值水平，提高CD4+T細胞的數量［12］。結合IL2的傳染性法氏囊病病毒核酸疫苗免疫后，可以對該病毒的攻毒產生保護。添加IL2的球蟲核酸疫苗免疫后，可以增加抗體的產生，改善雞攻蟲后的臨床癥狀。IFN-γ和IL-15同樣也被成功地運用，IFN-γ可以提高對球蟲和新城疫病毒的保護；IL-15可以增加CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的水平，增加對禽流感病毒的體液免疫和細胞免疫水平以及對球蟲感染的免疫保護［13］。CpG核酸序列可以被雞TLR21識別，可以有效增強對傳染性法氏囊病病毒和傳染性支氣管炎病毒的免疫保護作用。其他一些分子如IL-1、IL-4、IL-6、IL-17、IL-18、GM-CSF、IFN-α、CD145、TGF-β4、HMGB1、MDA5、LTB都有被用來增強禽用核酸疫苗的免疫效果。鴨上面的研究較少，IFN-γ、IL-2、CD154被用來增強對鴨乙型肝炎病毒的免疫保護效果［14］。

6　質粒骨架的優化和密碼子優化

多數情況下，禽用核酸疫苗的載體和哺乳動物所用的載體類似。有部分研究人員選用pCAGGS質粒，其啟動子是雞的β肌動蛋白啟動子，大多數情況下，這種質粒的效果沒有與病毒CMV質粒進行比較。當與經典的質粒進行比較時，有兩個研究結果相互矛盾，一項研究表明pCAGGS質粒針對流感病毒可以激發更高的抗體應答，另一項研究則恰恰相反［15-16］。

當把抗原的密碼子優化成宿主偏好的密碼子時，疫苗的效力可以得到提高，這在鴨上的一項流感病毒的研究中得到證明。對雞的網狀內皮組織增生病毒和傳染性法氏囊病病毒的研究表明，抗原密碼子優化和mRNA合成增加可以提高這兩種病原核酸疫苗的免疫保護效果。

7　多種抗原共表達

多數情況下，研究人員用一種抗原進行免疫，往往可以激發較好的免疫應答。然而，鑒定具有很好免疫保護的抗原有時候并不容易。因此，也有采用兩種或多種抗原研究核酸疫苗。在雞上，合并雞傳染性法氏囊病病毒VP2、VP4和VP3可以激發比單抗原VP2更好的免疫反應［17］。同樣，在雞傳染性支氣管炎病毒、呼腸孤病毒、禽多殺巴氏桿菌等核酸疫苗免疫過程中，多抗原比單抗原的效果要好。有時候，為了激發交叉保護，需要把不同型病毒或細菌的抗原合并在一起免疫雞，這在流感病毒和雞傳染性法氏囊病病毒中取得成功。

8　異源性的初免-加強免疫策略

單獨一次核酸免疫有時候不能激發較好的免疫保護，需要在加強免疫時采用該抗原的蛋白疫苗或活載體疫苗，這就是異源性的初免-加強免疫策略。與在哺乳動物上的研究一樣，禽上的研究也證明了該種策略在提高疫苗效力方面效果顯著。在禽上，一般初免用DNA疫苗，加強免疫用蛋白疫苗或痘病毒活載體疫苗［18］。對于雞傳染性法氏囊病病毒，DNA初免-蛋白加強免疫可以對該病毒的攻毒感染產生100%的保護（用VP2抗原作為疫苗抗原）。對于球蟲和流感病毒，該策略同樣有效。在火雞上，這種免疫策略對鸚鵡熱衣原體感染可以提供一些保護。加強免疫用滅活的疫苗對于禽流感病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的感染可以提供保護。對于雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、球蟲病核酸疫苗，蛋內初免DNA免疫，而后加強免疫，也可以提高疫苗的效力。對于鴨乙型肝炎病毒，初免用DNA疫苗，加強免疫用痘病毒疫苗，顯示對這種慢性病毒的感染有較好的治療作用。

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Strategies to improve DNA vaccine efficacy of poultry

Yi Weimeng Yin Guangwen Huang Juhui Jiang heji Huang Zhijian*
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals，Fuzhou 350002）

DNA vaccination is a promising alternative strategy for developing new human and animal vaccines.The massive efforts made these past 25 years to increase the immunizing potential of this kind of vaccine are still ongoing.A relatively small number of studies concerning poultry have been published.In this review，strategies designed to improve DNA vaccine efficacy will be described∶influence of the route of administration，plasmid dose and age of birds on their first inoculation，increasing plasmid uptake by host cells，addition of immunomodulators；optimization of plasmid backbones and codon usage，association of vaccine antigens and finally，heterologous prime-boost regimens.

DNA vaccine Avian Routes

A

1003-4331（2016）05-0047-03

國家自然科學基金（31502058）、福建省教育廳科研項目（JA15159）、大學生創新項目（201510389029）資助。

衣偉萌（1995-），女，山東棲霞人，本科生，主要從事動物寄生蟲病研究。Email：Yiweimeng11@163.com。

黃志堅（1963-），男，福建惠安人，教授，從事動物疾病防治與保健。E-mail：huangzj1999@sina. com。