禽核酸疫苗的研究進展

唐靜靜　周巧麗　殷光文　江和基　黃志堅（福建農林大學動物科學學院福建省動物藥物工程實驗室福州350002）

禽核酸疫苗的研究進展

唐靜靜周巧麗殷光文江和基黃志堅*
（福建農林大學動物科學學院福建省動物藥物工程實驗室福州350002）

本文對禽用（雞、鴨、火雞）核酸疫苗的研究進行綜述。首先描述禽用核酸疫苗的進展：病原，質粒以及免疫途徑。其次，描述提高核酸疫苗免疫效果的方式：接種途徑，疫苗劑量以及首免時間，增加宿主細胞對質粒的攝入，添加免疫增強分子，優化質粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強免疫策略。最后，描述禽用核酸疫苗的其他特點：接種后質粒的去向，免疫反應的特點以及核酸疫苗的其他用途。

核酸疫苗禽類傳染病佐劑免疫途徑

禽用核酸疫苗由載體和其表達的病原抗原組成，可以在動物體內產生體液免疫和細胞免疫應答；核酸疫苗適于大規模免疫，安全、便宜，可以區分野毒感染；核酸疫苗可以在常溫下保存較長時間，儲存運輸方便；此外，球蟲核酸疫苗可以減少抗球蟲藥物的使用，進而減少肉類獸藥殘留。

1　禽類核酸疫苗免疫模式

1990年，Wolff發現在小鼠肌肉內注射質粒，可以引起目標蛋白的顯著表達［1］。這是核酸免疫的最早研究，隨后，人、動物包括禽類上面的核酸疫苗研究越來越多，目前已經有四種動物用核酸疫苗上市（馬西尼羅河病毒疫苗、犬黑色素瘤疫苗、魚傳染性造血組織壞死病疫苗以及豬生長激素釋放激素疫苗）。但是目前還沒有禽用核酸疫苗上市。

文獻中有75%的禽用核酸疫苗研究針對雞，20%針對鴨，剩下的針對火雞。有75%的研究針對病毒病，20%的研究針對球蟲病，剩下的針對細菌病。

1993年最早的禽用核酸疫苗是針對禽流感病毒［2］。之后，在雞上，流感病毒的核酸疫苗研究越來越多，鴨上也有部分研究。流感病毒的核酸疫苗已經取得比較好的效果，基于HA蛋白的核酸疫苗一次免疫可以對致死攻毒產生90%以上的保護。另外一項研究用沙門氏菌活載體攜帶核酸疫苗口服免疫雞，也可以提供很好的保護，免疫后2周和4周，雞體內的CD4+和CD8+均有顯著增加，雞血清的血抑效價和機體內Th1類的細胞因子也比對照組高。傳染性法氏囊病毒核酸疫苗的研究也取得不錯的進展，一項研究首免用核酸疫苗，加強免疫用蛋白疫苗（所選抗原為VP2），用強毒攻毒，產生完全的保護［3］；另一項研究，首免用核酸疫苗進行蛋內免疫（所選抗原為VP243），加強免疫用滅活的病毒疫苗免疫，同樣對試驗攻毒可以產生完全的保護。雞傳染性支氣管炎病毒的核酸疫苗研究也比較多，質粒表達S1、N或者M蛋白免疫后可以對攻毒產生60%～90%的保護。在鴨上面，研究最多的核酸疫苗是針對鴨肝炎病毒，核酸疫苗免疫可以對該病毒的感染產生一定的抗病毒效應［4］。針對雞其他病毒的核酸疫苗研究較少。基于呼腸孤病毒σ蛋白的核酸疫苗可以產生66.7%～75%的保護。滴鼻免疫基于新城疫F蛋白的核酸疫苗可以對新城疫病毒的攻毒產生完全的保護。核酸疫苗在馬立克氏病病毒上可產生55%的保護。傳染性喉氣管炎病毒的核酸疫苗（基于gpB蛋白）免疫后可以減少65%～75%的死亡率。基于網狀內皮增生性病毒gp90的核酸疫苗免疫后可以引起中和抗體反應以及淋巴細胞增生，可以對攻毒后雞的貧血產生保護［5］。雞貧血病毒的核酸疫苗也可以引起雞的血液中和抗體，IL-2和IFN-γ，以及脾細胞增生，可以對攻毒后雞的貧血產生部分保護［6］。基于火雞鼻氣管炎病毒F蛋白的核酸疫苗免疫后，攻毒7 d后出現臨床癥狀的火雞從50%～60%降低到20%～30%［7］。鴨腸炎病毒核酸疫苗免疫后可以在鴨體內產生IgG、IgA以及中和抗體，攻毒后，80%的鴨可以存活［8］。基于鴨瘟病毒gpC抗原的核酸疫苗免疫后可以誘導鴨產生IgG，中和抗體，還可以產生淋巴細胞增殖反應［9］。

球蟲核酸疫苗研究也比較多，這些核酸疫苗免疫后大部分均可以產生較好的免疫反應，對球蟲的攻毒可以產生部分保護，臨床指標如體重損失、腸道病變計分以及卵囊排出量均有明顯改善［10］。

禽用細菌核酸疫苗研究較少。基于火雞鸚鵡熱衣原體MOMP抗原的核酸疫苗免疫后在火雞體內產生的抗體水平較低，對試驗感染產生的保護水平也不高［11］。空腸彎曲弧菌的核酸疫苗免疫雞后可以顯著減少雞腸道細菌載量。基于多殺巴氏桿菌Omp H和Omp A的核酸疫苗免疫后可對細菌感染產生75%的保護［12］。

2　禽類核酸疫苗質粒選擇

核酸疫苗基本上包括載體質粒及其表達的蛋白。禽用核酸疫苗的載體和哺乳動物所用的載體類似，主要有pcDNA、pVAX和pCI等。這些質粒都包括一個來源于病毒的強啟動子和終止序列。有部分研究人員選用pCAGGS質粒，其啟動子是雞的β肌動蛋白啟動子，可以增強疫苗的效力。在某些情況下，人們選用pIRES質粒，該質粒可以同時表達兩種抗原，或者表達一種抗原和一種佐劑分子［13］。

3　禽類核酸疫苗免疫途徑和劑量

免疫途徑主要包括四種：肌肉注射、皮內或皮下注射、黏膜免疫（經口或滴鼻免疫）以及蛋內注射。雞首免的日齡從1日齡到5～6周齡。大部分情況下，核酸疫苗溶在水溶液中被直接注射到胸肌或腿肌，一般多點注射，如首免注射左腿肌肉，二免注射右腿肌肉［14］。有的研究人員將肌肉注射與其他免疫方式（滴鼻、腹腔注射、皮內或靜脈注射）混用。口服免疫是第二種較普遍的免疫方式，通常是用致弱的細菌如沙門氏菌或大腸桿菌攜帶質粒，用細菌口服免疫雞。比較少的情況下，質粒與微球如聚乳酸-羥基乙酸共聚物或殼聚糖混合滴鼻免疫雞。黏膜免疫更適合大規模免疫，細菌和微粒可以霧化到空氣中，或添加到水和食物中。在雞胚18日齡時進行蛋內免疫對雞來說是一種最有效的大規模免疫方式，蛋內免疫可以用儀器自動進行，一次蛋內免疫通常不能激發很好的保護性免疫應答，在7 d或14 d用致弱的活疫苗或重組的痘病毒疫苗加強免疫可以比傳統免疫方式激發更好的免疫反應［15］。加強免疫用核酸疫苗也可以激發一定的保護性免疫應答。

70%的研究選用的免疫劑量為50～200 ug質粒，10%的研究如果注射點用電擊或其他方式加強吸收，可以選用較少的質粒劑量。還有研究人員選用的質粒劑量比較大，多達500 ug或10 mg，這種情況下，疫苗的花費將比較大，將影響其工業化應用。

研究人員通常用核酸疫苗以同樣的方式進行兩次或多次注射誘導保護性免疫反應。還有一些加強免疫通常是為了提高后代母源抗體的水平，或者制備診斷血清，或者治療慢性傳染病。免疫間隔時間沒有固定的標準，通常為1周～4周，比較普遍的間隔時間是1周或2周，這種間隔時間通常可以有效激活機體的免疫系統。

4　提高核酸疫苗效果的方式

通常核酸疫苗免疫激發的保護性免疫應答效果有限，需要采取一些方法進行改善。需要考慮的方面如下：接種途徑，疫苗劑量以及首免時間，增加宿主細胞對質粒的攝入，添加免疫增強分子，優化質粒骨架和密碼子，疫苗抗原的選擇，異源性的首免-加強免疫策略。

5　禽用核酸疫苗的其他特點

很少有人研究核酸疫苗是怎樣在禽上激發保護性免疫應答的。不過，有一些研究描述了接種后質粒的命運。還有一些研究核酸疫苗免疫后，對特定免疫細胞的刺激作用，以及母源抗體對免疫的影響。有人研究核酸疫苗免疫后的其他作用。

5.1核酸疫苗免疫后質粒的去向核酸疫苗免疫后質粒在雞體內的去向研究得比較少。免疫后第5d和第15 d，在雞的血液、肝臟、脾臟、肺部、腎臟、肌肉以及心臟均可以發現質粒。但在哺乳動物上，肌肉注射的部位多達3周均可以檢測到質粒，但是其他肌肉部位，僅僅在免疫后1～7 d可以檢測到。免疫后，沒有發現質粒DNA可以整合到宿主DNA中，也沒有發現質粒DNA進入到雞腸道細菌中。用沙門氏菌載體攜帶核酸質粒經口免疫，免疫后多達6周都可以在雞的脾臟、肝臟、盲腸檢測到質粒。蛋內免疫2 h，在雞的尿囊液中已檢測不到質粒。質粒已經到達雞胚并分布到雞的全身［16］。

5.2核酸疫苗的免疫學核酸疫苗可以激發宿主的體液免疫和細胞免疫應答。研究發現，免疫后雞和鴨的CD4+和CD8+T細胞均可以增值［17］。雞的先天性免疫系統到4周的時候才會完全發育成熟，因此，幼齡雞在出生后2周到3周需要母源抗體的保護。但是，很少有研究報道母源抗體對禽用核酸疫苗免疫效果的影響。大多數情況下，研究人員用SPF雞或者沒有母源抗體的雞做試驗。少數的幾項研究表明，在有母源抗體的情況下，需要加大質粒的劑量、增加免疫次數才可以對雞傳染性法氏囊病病毒的感染激發較好的免疫保護。對于新城疫病毒，母源抗體則阻礙了核酸疫苗的效果。在火雞上，母源抗體影響了核酸疫苗對鸚鵡熱衣原體的體液免疫應答，但對細胞免疫和保護性免疫應答沒有影響［18］。

5.3禽用核酸疫苗的其他應用大多數情況下，DNA免疫是要誘導機體產生預防性的保護性免疫應答。但是，DNA免疫也有其他一些應用。有研究人員將DNA疫苗與藥物聯合應用治療鴨乙型肝炎病毒感染；DNA免疫被用來生產用于診斷的參考血清；DNA免疫被用來產生針對蝦白斑綜合征病毒的抗體［19］。DNA免疫還被用來延緩雞腫瘤的發生［20］。

6　結論

DNA免疫對于禽類（雞、鴨、火雞）來說是一種簡單合適的免疫方式。該種免疫方式在對抗禽類病毒、細菌以及球蟲方面都取得了成功。一些方法可以被用來增強疫苗的免疫效果；一些免疫方法適合大規模免疫。盡管自1993年以來有大量的禽用核酸疫苗研究，但是目前還沒有一種進入商業化生產。可能是因為大部分研究采用的是肌注方式，而且免疫了至少兩次，這些在實際應用中并不方便。還有大量的研究采用SPF動物，而實際中大部分幼齡雞可能存在母源抗體，在某種程度上會影響DNA疫苗的效果。盡管這樣，還是有一些研究在母源抗體存在的情況下取得了免疫保護，表明至少針對某些病原，母源抗體并不影響核酸疫苗的效果。因此，我們需要采取更多的方法開發適合大規模應用、可以克服母源抗體干擾的禽用核酸疫苗。

［1］Wolff J A，Malone R W，Williams P，et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo［J］.Science，1990，247（4949）：1465-1468.

［2］Robinson H L，Hunt L A，Webster R G.Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a haemagglutinin-expressingplasmidDNA［J］.Vaccine，1993，11（9）：957-960.

［3］Honglei Gao，Kai Li，Li Gao，et al.DNA prime-protein boost vaccination enhances protective immunity against infectious bursal disease virus in chickens［J］.Vet Microbiol，2013，164（1/2）：9-17.

［4］Rollier C，Charollois C，Jamard C，et al.Early life humoral response of ducks to DNA immunization against hepadnavirus large envelope protein［J］.Vaccine，2000，18（27）：3091-3096.

［5］Kai Li，Li Gao，Honglei Gao，et al.Protection of chickens against reticuloendotheliosis virus infection by DNA vaccination［J］.Vet Microbiol，2013，166（1/2）：59-67.

［6］Moeini H，Omar A R，Rahim R A，et al.Improving the potency of DNA vaccine against chicken anemia virus（CAV）by fusing VP1 protein of CAV to Marek's Disease Virus（MDV）type-1 VP22 protein［J］.Virol J，2011，8：119.

［7］Kapczynski D R，Sellers H S.Immunization of turkeys with a DNA vaccine expressing either the F or N gene of avian metapneumovirus［J］.Avian Dis，2003，47（4）：1376-1383.

［8］Xia Yu，Renyong Jia，Juan Huang，et al.Attenuated Salmonella typhimurium delivering DNA vaccine encoding duck enteritis virus UL24 induced systemic and mucosal immune responses and conferred good protection against challenge［J］. Vet Res，2012，43：56.

［9］Bei Lian，Anchun Cheng，Mingshu Wang，et al.Induction of immune responses in ducks with a DNA vaccine encoding duck plague virus glycoprotein C［J］.Virol J，2011，8：214.

［10］Qianming Xu，Xiaokai Song，Lixin Xu，et al.Vaccination of chickens with a chimeric DNA vaccine encoding Eimeria tenella TA4 and chicken IL-2 induces protective immunity against coccidiosis［J］.Vet Parasitol，2008，156（3/4）：319-323.

［11］Vanrompay D，Cox E，Volckaert G，et al.Turkeys are protected from infection with Chlamydia psittaci by plasmid DNA vaccination against the major outer membrane protein［J］.Clin Exp Immunol，1999，118（1）：49-55.

［12］Qiang Gong，Ning Qu，Mingfu Niu，et al.Immune responses and protective efficacy of a novel DNA vaccine encodingouter membrane protein of avian Pasteurella multocida［J］. Vet Immunol Immunopathol，2013，152（3/4）：317-324.

［13］Hongying Chen，Li Zhao，Zhanyong Wei，et al.Enhancement of the immunogenicity of an infectious laryngotracheitis virus DNA vaccine by a bicistronic plasmid encoding glycoprotein B and interleukin-18［J］.Antiviral Res，2010，87（2）：235-241.

［14］Sawant P M，Verma P C，Subudhi P K，et al.Immunomodulation of bivalent Newcastle disease DNA vaccine induced immune response by co-delivery of chicken IFN-gamma and IL-4 genes［J］.Vet Immunol Immunopathol，2011，144（1/2）：36-44.

［15］Haygreen E A，Kaiser P，Burgess S C，et al.In ovo DNA immunisation followed by a recombinant fowlpox boost is fully protective to challenge with virulent IBDV［J］.Vaccine，2006，24（23）：4951-4961.

［16］Xicheng Ding，Hyun S Lillehoj，Rami A，et al.DalloulIn ovo vaccination with the Eimeria tenella EtMIC2 gene induces protective immunity against coccidiosis［J］.Vaccine，2005，23（28）：3733-3740.

［17］Jazayeri S D，Ideris A，Zakaria Z，et al.Improved immune responses against avian influenza virus following oral vaccination of chickens with HA DNA vaccine using attenuated Salmonella typhimurium as carrier［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2012，35（5）：417-427.

［18］Van Loock M，Lambin S，Volckaert G，et al.Influence of maternal antibodies on Chlamydophila psittaci-specific immune responses in turkeys elicited by naked DNA［J］. Vaccine，2004，22（13/14）：1616-1623.

［19］Yanan Lu，Junjun Liu，Liji Jin，et al.Passive protection of shrimp against white spot syndrome virus（WSSV）using specific antibody from egg yolk of chickens immunized with inactivated virus or a WSSV-DNA vaccine［J］.Fish Shellfish Immunol，2008，25（5）：604-610.

［20］Plachy J V，Hejnar J V，Trtkova K，et al.DNA vaccination against v-src oncogene-induced tumours in congenic chickens［J］.Vaccine，2001，19（31）：4526-4535.

DNA vaccination of poultry

Tang Jingjing Zhou Qiaoli Yin Guangwen Jiang heji Huang Zhijian*
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals，Fuzhou 350002）

This review describes studies in this field performed exclusively on birds（chickens，ducks and turkeys）.No evaluations of avian DNA vaccine efficacy performed on mice as preliminary tests have been taken into consideration.The review first describes the state of the art for DNA vaccination in poultry∶pathogens targeted，plasmids used and different routes of vaccine administration.Second，it presents strategies designed to improve DNA vaccine efficacy∶influence of the route of administration，plasmid dose and age of birds on their first inoculation；increasing plasmid uptake by host cells；addition of immunomodulators；optimization of plasmid backbones and codon usage；association of vaccine antigens and finally，heterologous prime-boost regimens.The final part will indicate additional properties of DNA vaccines in poultry∶fate of the plasmids upon inoculation，immunological considerations and the use of DNA vaccines for purposes other than preventing infectious diseases.

DNA vaccine Avian Infectious diseases Adjuvants Routes

A

1003-4331（2016）05-0050-04

國家自然科學基金（31502058）、福建省教育廳科研項目（JA15159）、大學生創新項目（201610389148）資助。

唐靜靜（1993-），女，河南商丘人，本科生，主要從事動物醫學研究。Email：970339298@qq.com。

黃志堅（1963-），男，福建惠安人，教授，從事動物疾病防治與保健。E-mail：huangzj1999@sina. com。