在線色譜聯用技術檢測天然產物抗氧化活性的研究進展△

王媛媛　馬飛祥　李鳳英　王怡諾　薛培鳳（內蒙古醫科大學藥學院　呼和浩特　010110）

在線色譜聯用技術檢測天然產物抗氧化活性的研究進展△

王媛媛馬飛祥李鳳英王怡諾薛培鳳*（內蒙古醫科大學藥學院呼和浩特010110）

大量研究表明自由基損傷與腫瘤、糖尿病、心血管系統疾病等多種疾病的發生有密切關系，因此快速發現天然產物中抗氧化活性成分對于闡明藥物的作用原理、疾病的發病機制和新藥創制具有重要意義。本文主要介紹了HPLC-DPPH法、HPLC-CL法、HPLC-ABTS+法等一系列在線色譜法的原理及其在測定抗氧化能力中的應用，闡述了近年來在線色譜在檢測天然產物抗氧化活性方面的研究。

在線色譜 檢測 抗氧化活性

抗氧化劑包括人造抗氧化劑和天然抗氧化劑。20世紀80年代，鑒于人造抗氧化劑的安全性飽受爭議，人們越來越傾向于開發使用天然抗氧化劑。草藥、水果和蔬菜中具有抗氧化的天然成分用作食品、化妝品和藥品已成為近年來的研究熱點［1］。因此，尋求一種行之有效的檢測抗氧化活性的方法，對食品、化妝品和藥品抗氧化活性的快速測定等都具有重要的意義。就目前的研究進展而言，抗氧化方法主要包括兩大類，即傳統抗氧化檢測方法和在線抗氧化檢測方法。

1　抗氧化活性的傳統檢測方法

傳統的植物天然抗氧化活性成分通常采用先提取、分離、鑒定各種成分后再分別對各成分進行抗氧化活性測定［2］。已經使用的檢測抗氧化活性的方法，例如DPPH、ABTS、CL等，只能對物質總體的抗氧化能力進行檢測，不能確定物質中何種化合物具有抗氧化能力以及進行定量分析，只有在對某種化合物進行分離純化后才能測定。傳統的對單一組分的抗氧化劑進行提取分離時易導致化合物抗氧化能力的改變，且操作工藝煩瑣。多年來，以這樣的方法也檢測出了一些抗氧化成分，但這些方法往往難以在分離過程中選定篩選目標，顯然效率較低。如下對一些檢測抗氧化活性的傳統方法進行簡要概述。

1.1DPPH法：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種人工合成的、以氮為中心的、穩定的自由基。由于DPPH溶液在最適波長517nm處有最大吸收峰，當有抗氧化活性成分存在時，可以與DPPH的孤對電子配對，而使其吸光度降低，其降低的程度與待測物質的抗氧化能力成正比，故該法不僅能夠通過吸收度的降低程度評價物質的抗氧化能力，還能夠進行定量分析。但在評價成分復雜提取物的抗氧化能力時，該法最大的不足在于只能檢測出提取物總體的抗氧化能力，無法獲知其中某一單體化合物的抗氧化活性，只有再經分離純化才可確定。然而，一些化合物會由于在分離純化過程中的分解作用而導致活性發生變化，不能很準確地評價待測物質的抗氧化能力。

1.2ABTS＋·法：ABTS化學名為2，2'-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），是近年來應用頻率較高的一種用于檢測抗氧化活性的還原型無色物質。其通過與K2S208、Mn02、ABAP、H202、過硫酸銨作用，導致被氧化成藍綠色的自由基陽離子ABTS＋·。該法最早由Miller于1993年提出［3］，由于ABTS＋·在734nm處有特征吸收峰，當具有供氫能力的抗氧化劑與之反應時，會使其在734nm處的吸光值發生急劇變化，根據其變化程度的大小評價待測物質的抗氧化能力。有時，為了比較多種抗氧化劑的活性，通常會將活性抗氧化物質與含trolox（6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸）的標準抗氧化劑分別與ABTS＋·作用，測定結果以TEAC值作為指標，即TEAC為被測抗氧化劑與標準抗氧化劑清除ABTS＋·能力的比值，所以ABTS＋·法也被稱為TEAC法。相對于抗氧化能力的體內檢測方法，該法具有設備簡單、經費消耗少、簡便、迅速等優點。但由于ABTS＋·也可能會與任何羥基化的芳香族化合物發生反應，導致其專一性差，高估被測物質的抗氧化能力。

1.3化學發光法：化學發光（CL）法的基本原理是發光試劑能被活性自由基氧化，生成的激發態氧化產物會伴隨著能量衰減以發出光子的形式回到基態。當待測物質中含有抗氧化劑時，抗氧化劑會清除活性自由基，使原本的發光強度降低［4］。利用儀器對清除前后吸光值予以檢測，評價待測物的抗氧化能力。除此之外，該技術亦可適用于生物體液的抗氧化活性分析［5］，具有靈敏度高、線性范圍寬、分析能力強等特點。

2　抗氧化活性的在線色譜聯用檢測技術

近些年來，隨著色譜技術的發展，研究者們建立了各種在線檢測抗氧化活性的色譜聯用技術，主要是將各種具有分離功能的色譜技術與抗氧化篩選技術相結合，旨在分離的同時實現化合物的在線鑒定與定量分析，消除了傳統方法先分離、再測活的煩瑣過程。此法與離線檢測方法相比具有自動化、穩定化、快速化、規范化等優點［6］。以下對近年來各種在線色譜檢測抗氧化活性的原理及應用簡單介紹。

2.1結合DPPH檢測抗氧化活性的方法

2.1.1HPLC-UV-DPPH法：HPLC-DPPH法利用色譜柱對復雜成分進行分離后與DPPH直接相連，選定516nm作為檢測波長，由于具有抗氧化能力的活性物質能夠捕獲DPPH的孤對電子而使得原有的峰面積下降甚至表現為倒峰，其倒峰面積與待測物質清除DPPH的能力有一定的關系，該技術快速、高效、操作簡單，實現了見“圖”識“效”的作用，不失為一種快速檢測天然產物中抗氧化成分的重要手段。目前，國內已有諸多學者利用該技術手段對某些天然藥物進行抗氧化活性的在線篩選。如王小淞等［7］通過結合紫外檢測器建立起的HPLC-UV-DPPH法對黃芩根、莖、葉提取物的抗氧化活性進行在線檢測；實驗結果表明：黃芩根、莖、葉部位的提取物均可作為一種很好的抗氧化劑，但所含的抗氧化活性成分及含量有較大差異，故可以此評價黃芩各有效部位抗氧化能力。柳艷等［8］也利用該技術對植物中多酚類成分進行了抗氧化活性的研究，結果顯示：HPLC-UVDPPH流動注射在線色譜聯用技術可以實現對多組分植物化學物抗氧化能力的高通量篩選。邢航等［9］通過此技術證實了葡萄酒中也含有多種抗氧化活性物質。Shanshan Tong等［10～11］利用該方法以水飛薊素為研究對象進行抗氧化活性的在線檢測。Zong-Quan 0u［12］也運用該法提取出了苦菜葉中的抗氧化活性物質。以上實驗結果均表明該法能夠實現對抗氧化活性成分的在線檢測分析，尤其是在比較中藥各有效部位的提取物的抗氧化能力大小方面有很好的應用前景。

2.1.2HPLC-DAD-DPPH法：HPLC-DAD-DPPH法是目前檢測天然植物中抗氧化活性成分應用較多的聯用技術之一。如張作法等［13］采用活性自由基與HPLC-DAD聯用，首次對桑枝中的主要抗氧化活性成分進行測定，并比較其在不同桑枝品種中的含量，為深度開發桑枝的藥效打下堅實的基礎。

其他學者也使用此方法進行了相關性地研究，如王春鵬等［14］，建立HPLC-DAD-DPPH甲醇枸櫞酸在線抗氧化活性指紋圖譜體系，篩選出金銀花抗氧化作用的有效組分及檢測其抗氧化能力的強弱，并基于此對不同產地金銀花進行質量評價。此項實驗結論指出此方法簡便可行，基于活性整合指紋圖譜篩選出藥材中的抗氧化活性成分，在全面有效地評價中藥質量的道路上邁出了堅實的一步。

2.1.3HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH法：王虹等［1］的研究在HPLCDPPH法的基礎上，結合ESI-T0F/MS進行分析，以茶葉提取物為研究對象，建立一種適用于天然產物提取物中抗氧化活性成分快速篩選與鑒定的方法，填補了傳統方法中無法實現某一單體化合物快速檢測其抗氧化活性的空白。同時，耿丹丹等［15］在HPLC-DAD-DPPH法的基礎上通過結合質譜檢測器對丹參和康定鼠尾草中的天然抗氧化活性成分進行快速篩選，鑒定出其活性化合物的具體結構。

這兩項實驗結果都表明該技術操作簡便，重復性好，與傳統的天然產物中復雜成分的分離與鑒別模式相比，該聯用技術能夠同時實現對復雜化合物中抗氧化活性成分的鑒定與定量分析，提高了工作效率。

2.2結合ABTS+·檢測抗氧化活性的方法

2.2.1HPLC-UV-ABTS+·法：在線HPLC-UV-ABTS+·檢測抗氧化活性成分的方法是將高效液相色譜、紫外檢測器與檢測清除自由基的ABTS+·試劑檢測器連接，在高效液相色譜儀分離組分的同時實現了對抗氧化活性成分的篩選，提高了檢測效率。高翔等［3］利用HPLC在線檢測消癌平注射液對ABTS+·的清除能力，探究其抗氧化活性的物質基礎。研究結果表明該中藥制劑中的酚酸類物質對ABTS+·有較強的清除作用，能夠實現對傳統中藥制劑抗氧化活性組分的快速檢測。耿雪飛［16］和裴世春等［17］也利用該在線色譜法實現了對細葉杜香葉中抗氧化活性成分的測定。基于此，我們認為，該在線色譜聯用技術能夠一改傳統的篩選方法，有效地提高天然藥物中抗氧化活性物質的篩選效率。

2.2.2HPLC-DAD-ABTS+·法：HPLC--DAD-ABTS+·在線檢測法是一種簡便快捷、不需要對復雜樣品進行分離純化的檢測抗氧化活性成分的方法，能夠對復雜混合物中清除自由基的活性成分進行分離以及在線測定。王宇卿等［18］學者就是采用該法完成了對生脈散和益氣復脈粉針清除ABTS+的活性成分的在線檢測，并比較了兩者體外抗氧化活性成分的含量。

2.3結合CL檢測抗氧化活性的方法

2.3.1HPLC-UV-CL法：CL與具有高效分離特性的HPLC相連，采用紫外分光光度計進行檢測，使之成為一種有效的痕量分析技術。近年來，HPLC-CL聯用法發展迅速，已成功地運用于黃酮、多酚、兒茶酚胺、芳香族化合物等的檢測。朱卉等［19］采用該技術已成功檢測出消癌平注射液中活性組分酚酸類物質對H202和0·2-自由基的清除能力，并結合質譜對其活性成分進行鑒別。通過以上介紹得出：HPLC-UV-CL在線聯用技術使用簡單、高效，可實現對中藥注射液中抗氧化活性成分的在線篩選。

2.3.2HPLC-DAD-CL法：LI Yi等［20］利用HPLC-DAD-CL在線檢測冠心寧（GXN）注射液的主成分丹參和川芎的抗氧化活性。通過優化分析條件，對來自14個生產批次的冠心寧注射液的15種酚酸的H202抑制速率進行測定。結果顯示：15種酚酸均具有抗氧化活性且丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸是冠心寧注射液（25.82%～51.19%）抗氧化的最主要活性成分，同時闡明了該中藥制劑的抗氧化作用機制及進行質控分析。與傳統方法相比，此項研究表明HPLC-DAD-CL在線聯用技術具有使用簡便、快捷和低成本等優點，可用于天然產物中抗氧化活性成分的快速篩選。

2.3.3HPLC-UV-CL法：陳乃東［21］與陳存武［22］等擬從霍山石斛抗氧化活性入手，采用HPLC-UV-CL聯用法對霍山石斛中總生物堿提取物的抗氧化能力進行在線測定以便快速發現存在于霍山石斛中的抗氧化活性物質，為后續的抗氧化活性物質的定向分離、霍山石斛的譜效關系及臨床應用提供理論依據，為探討新的中藥質量評價模式提供參考。最終的實驗結果指出采用HPLCUV-CL在線測定方法，以校正清除率為評價指標，可從含有結構類似物的中藥中快速發現抗氧化活性物質；然而，對于化學結構及消光系數相差較大的組分，峰面積相同的兩個組分，其代表的物質含量相差較大，以峰面積大小代表不同物質含量，誤差較大，導致校正抑制率評價抗氧化活性誤差較大。因此，在測定結構、消光系數相差較大的化合物抗氧化活性時具有一定的局限性［21～22］。

2.4CE-MS在線預濃縮檢測抗氧化活性方法：近幾年，因酚酸類化合物對氧化應激能產生防御作用，對其的研究引起了廣泛的關注。而毛細管電泳和質譜檢測器聯用（CE-MS）作為一種有效的可用于分離中性和帶電荷的化合物的分離工具，具有定性分析化合物結構信息的獨特優勢。如學者王文明［23］等的實驗采用CE-MS在線預濃縮方法率先對丹參酚酸類化合物中4種親水活性成分進行定性定量測定，成功地評價了其抗氧化能力。

盡管CE-MS在分析領域已獲得廣泛的應用，但與HPLCMS相比，CE-MS仍然存在檢測靈敏度偏低的缺陷。因此，建立CE-MS在線預濃縮技術，降低檢測限的方法已成為研究重點。目前，已有少數幾種改進CE-MS靈敏度的方法，其中樣品堆積技術是應用最廣泛的一種。近年來的研究證明了在線聯用HPLC能夠有效地清除自由基活性，但國內未見CE-MS測定酚酸類抗氧化活性的方法［23］。

2.5光纖傳感微量樣品羥自由基檢測抗氧化活性方法：羥自由基（·0H）是一種氧化能力很強的活性自由基，可以氧化糖類、脂類、蛋白質等生物大分子，導致它們的化學結構遭到破壞。因此，加強對自由基清除的研究勢在必行。古海妮薩·麥合木提［24］等采用Mn2+-H202-EBT方法，通過前期對反應體系吸光度的檢測，選定560nm作為最適檢測波長，對新疆葡萄樹傷流液、金銀花茶、羅布麻茶、茉莉茶和竹葉茶進行研究。其原理基于類似芬頓（Fenton）反應的化學反應，主要方程式為：Mn2++H202→Mn3++·0H+ 0H-，當向反應體系（Mn2+-EBT）加入H202時，生成的·0H能夠迅速氧化分解EBT與Mn2+反應生成的螯合物，使其560nm處的吸光度迅速下降，從而可間接地檢測出羥自由基（·0H）的產生量。而當有抗氧化劑存在時，它會抑制或者延緩螯合物的分解，從而對其待測物質的抗氧化能力進行評價。此法利用光纖作為傳輸通道，具有光信息傳輸損耗低、傳輸量大、不易受外界干擾等特點，并彌補了現在儀器以及傳統方法在測定物質抗氧化活性方面的不足且所需樣品量少、可連續觀察吸光度變化。

3　總結與展望

近年來建立的快速、高效、多系統聯用的在線色譜檢測抗氧化活性的方法同以往的方法相比，在技術上有了很大的創新，能夠在分離的同時進行活性測定，并在不同的藥物、植物或復方制劑的抗氧化活性檢測中得到驗證。但也有不足之處，大多數實驗研究在檢測抗氧化活性方面的試劑僅僅局限于 ABTS、DPPH。未來，我們需要探索出更多的檢測試劑，以便能夠更快、更好地對天然藥物及復方制劑進行檢測。

今后，我們應該努力開發及改進現有的在線色譜抗氧化活性檢測方法，建立更快速、直觀的在線抗氧化活性檢測及評價方法。以便發現天然產物中有效的抗氧化成分，推動中醫藥事業發展。

［1］王虹，陳軍輝，趙恒強，等.高效液相色譜-質譜-二苯基三硝基苯肼在線篩選與鑒別茶葉中抗氧化活性成分 ［J］.分析化學（FENXI HUAXUE）研究報告，2009，37（6）：795-800.

［2］楊華，韓坤，宛曉春，等.野葛異黃酮糖苷的分離純化及體外清除自由基活性的研究［J］.安徽農業大學學報，2011，38（2）：146-150.

［3］高翔，王燕，朱丹妮，等.HPLC在線檢測消癌平注射液清除ABTS+·活性［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（5）：54-57.

［4］龐媛.天然產物抗氧化組分的毛細管電泳-化學發光法篩選與評價［D］.重慶：重慶大學，2010.

［5］張華.柑橘果實快速高效在線抗氧化活性評價方法的建立及其應用研究［D］.重慶：西南大學，2014.

［6］陳芳芳.基于色譜聯用技術對茶葉成分的分離制備及其抗氧化活性的檢測［D］.廈門：廈門大學，2014.

［7］王小淞，陳波，姚守拙.HPLC-DPPH在線法篩選黃芩提取物中抗氧化活性成分［J］.中草藥，2009，40（增）：224-227.

［8］柳艷，傅博強，李磊，等.植物多酚抗氧化活性高通量標識和篩選技術研究［C］.中國毒理學會食品毒理學專業委員會，2008：115-120.

［9］邢航，張媛婷，魯雪峰，等.高效液相色譜－二苯基三硝基苯肼在線檢測葡萄酒中抗氧化活性成分 ［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（21）：127-131.

［10］Shanshan Tong，Chang Chu，Yuan Wei，et.Preparation and effects of 2，3-dehydrosilymarin，a promisingand potent antioxidant and free radical scavenger［J］.Journal Pharmacy and Pharmacology，Science Letter，2011，63：238-244.

［11］周瑋婷，張壯壯，康偉，等.水飛薊素及其脫氫衍生物的抗氧化活性研究［J］.北方藥學，2014，11（8）：82.

［12］Zong-Quan 0u，David M.Schmierera，Thomas Radesc.Et. Application of an online post-column derivatizationHPLC-DPPH assay to detect compounds responsible forantioxidant activity in Sonchus oleraceus L.leaf extracts［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology.2013，65：271-279.

［13］張作法，時連根.在線液相色譜法和液相色譜－電噴霧質譜聯用法檢測桑枝中抗氧化活性成分 ［J］.中國中藥雜志，2012，337 （6）：800-802.

［14］王春鵬，朱子微，李晉，等.金銀花抗氧化活性整合指紋圖譜的建立及其在質量評價中應用 ［J］.天津中醫藥大學學報，2014，33（5）：291-295.

［15］耿丹丹，董琦，譚亮，等.HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH在線篩選與鑒別丹參和康定鼠尾草中抗氧化活性成分［J］.分析測試學報，2015，34（3）：314-320.

［16］耿雪飛，鄭永杰，趙明，等.基于HPLC-ABTS體系篩選細葉杜香抗氧化活性成分［J］.化學工程師，2011，193（10）：70-73.

［17］裴世春，徐玖亮，UM Byunghun，等.HPLC-ABTS+·在線法篩選細葉杜香葉部抗氧化活性成分［J］.食品科學，2012，33（19）：88-91.

［18］王宇卿，朱丹妮，寇俊萍，等.HPLC-ABTS-DAD在線檢測生脈散和益氣復脈粉針的體外抗氧化能力［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，819（16）：51-54.

［19］朱卉，朱丹妮，余伯陽，等.HPLC-CL聯用在線檢測消癌平注射液檢測H202及02自由基活性 ［J］.中成藥，2010，8，32（8）：1386-1390.

［20］LI Yi，RUAN Ming，LU0 Jian-Guang，Et.0n-line antioxidant activitydetermination of main ingredients in Guan-Xin-Ning injection by HPLC-DAD-CL［J］.Chinese Journal of Natural Medicines 2012，10（6）：448-455.

［21］陳乃東，李俊，金暉，等.HPLC-UV-CL聯用研究霍山石斛生物堿清除自由基活性［J］.食品工業科技，2015，7，36（7）：276-280.

［22］陳存武，陳乃東，孟云飛，等.沉淀敲出法快速發現霍山產鐵皮石斛生物堿及其組分抗氧化活性在線測定［J］.天然產物研究與開發，2014，26：1000-1003，1013.

［23］王文明，段啟.毛細管電泳和質譜聯用在線預濃縮酚酸類化合物及其抗氧化活性評價 ［J］.中藥新藥與臨床藥理，2014，25 （3）：338-342.

［24］古海妮薩·麥合木提，艾爾肯·依不拉音.光纖傳感微量樣品抗羥自由基檢測方法的建立及其應用 ［J］.藥物分析雜志，2015，35（11）：1989-1994.

R285

A

1672-8351（2016）09-0123-03

內蒙古自然科學基金（2015MS0823）；內蒙古醫科大學實驗室開放基金（2016ZN01）。