生物傳感器測定農(nóng)藥類污染物2,4-D的檢測方法研究

和建萍　 潘學(xué)軍　 周小紅　 施漢昌　清華大學(xué)　昆明理工大學(xué)

生物傳感器測定農(nóng)藥類污染物2,4-D的檢測方法研究

和建萍1,2潘學(xué)軍2周小紅1施漢昌11清華大學(xué)2昆明理工大學(xué)

平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器(PWFI)是一種基于全內(nèi)反射熒光和免疫分析原理的具有高靈敏度的生物傳感器。本研究基于PWFI傳感器，利用間接免疫反應(yīng)原理，實(shí)現(xiàn)了對農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D的檢測，建立了運(yùn)用PWFI傳感器測定農(nóng)藥類小分子污染物的檢測方法。為水環(huán)境保護(hù)和突發(fā)性污染事故應(yīng)急監(jiān)測等提供快速、簡便、有效的技術(shù)支持。

生物傳感器；檢測；污染物；農(nóng)藥

農(nóng)藥在人類的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為防治病蟲草害發(fā)揮了重要的作用，但也帶來了環(huán)境污染問題。農(nóng)藥是化學(xué)藥品中毒性較高，降解緩慢的物質(zhì)，經(jīng)過長期積累、富集、遷移、轉(zhuǎn)化，在大氣、水體、食物鏈等介質(zhì)中擴(kuò)散傳遞，使環(huán)境空氣、環(huán)境水體、環(huán)境土壤和食物都受到不同程度的污染，危害人類健康。何光好于1998年對全國109,700km河流進(jìn)行的評價結(jié)果表明有70.6%的河流受到農(nóng)藥的污染[1]。大量研究結(jié)果顯示，長江、黃河、湖泊、水庫、海域等水體中均檢出有毒有機(jī)污染物質(zhì)[2]，有毒有機(jī)物引起的水環(huán)境污染問題已成為世界普遍關(guān)注的環(huán)境問題。

常用的微量有毒有機(jī)污染物檢測技術(shù)主要有：氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）[3]、氣液相質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MC）等，這些技術(shù)能靈敏準(zhǔn)確地檢測各種不同環(huán)境樣品中的有機(jī)污染物，但由于所用的儀器昂貴，使用環(huán)境要求較高，操作技術(shù)復(fù)雜，須由專業(yè)技術(shù)人員運(yùn)行管理，維護(hù)成本高等，廣泛普及應(yīng)用于一般環(huán)境監(jiān)測機(jī)構(gòu)還有很大的局限性。另外，在檢測過程中要求對樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，耗時長，時效性差，不能滿足環(huán)境污染事件現(xiàn)場應(yīng)急監(jiān)測的工作需要。生物傳感器是一類基于生物分子與污染物的特異性反應(yīng)對污染物進(jìn)行識別，并通過光學(xué)或電化學(xué)方法獲取信號的檢測系統(tǒng)。近年，生物傳感器的快速發(fā)展為其應(yīng)用于環(huán)境中微量有毒有機(jī)物的檢測展示了廣闊的前景。本文介紹了基于平面物波導(dǎo)-熒光免疫生物傳感器測定農(nóng)藥類污染物——2,4-D的檢測方法研究。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

本研究采用了清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院研發(fā)的平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器系統(tǒng)，如圖1所示。平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器系統(tǒng)由光路系統(tǒng)、流動進(jìn)樣系統(tǒng)、信號處理系統(tǒng)三部分組成[4]。其中，光路系統(tǒng)主要包括激發(fā)光路和熒光收集光路；流動進(jìn)樣與反應(yīng)系統(tǒng)主要包括免疫芯片、反應(yīng)池、進(jìn)樣閥和微量計量泵；信號處理系統(tǒng)主要包括控制電路和信號處理電路。

圖1　平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器系統(tǒng)

試驗(yàn)材料包括：修飾后具有特異性反應(yīng)點(diǎn)位的免疫芯片。Cy5.5標(biāo)記的2,4-D抗體（研究組自備），抗體稀釋液（研究組自備），2,4-二氯苯氧乙酸使用原液（2,4-D，Aldrich）（研究組自備），10mmol/L的PBS緩沖溶液，pH=1.9，濃度0.5%的SDS活化試劑，磷酸（H3PO4，分析純），氯化鈉（NaCl，分析純），氯酸鉀（KCl，分析純），磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純），磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O，分析純），超純水。（注：所用試劑除購自Sigma的試劑外，其余試劑均為國內(nèi)生產(chǎn)的分析純試劑）。

2 免疫芯片的修飾

檢測的核心元件是對2,4-D具有特異性免疫反應(yīng)的生物芯片。因此，首先要對玻璃傳感基片進(jìn)行清洗和表面羥基化，然后將基片浸入2%的3-巰基丙基三甲氧基硅烷（MTS）溶液，在基片表面引入巰基，將巰基化的基片用無水甲醇清洗，吹干備用。將巰基化的基片浸沒在0.002mol/L的N-琥珀酰胺基-4-馬來酰胺-丁酸脂（GMBS）雙功能試劑中（GMBS可與巰基和氨基發(fā)生反應(yīng)），雙功能試劑與基片表面結(jié)合，然后將15μl的2,4-D復(fù)合抗原溶液滴加于基片表面的檢測點(diǎn)位上，在4℃冰箱內(nèi)放置過夜以保證反應(yīng)完全，經(jīng)過反應(yīng)形成對2,4-D具有特異性吸附的檢測芯片。為了降低非特異性吸附對2,4-D檢測的干擾，需要對芯片產(chǎn)生非特異性吸附的表面進(jìn)行封閉。將清洗干凈的上述芯片浸沒于2mg/ml的BSA溶液中60min，反應(yīng)完全后用高純水沖洗干凈，用氮?dú)獯蹈?。最后，在芯片垂直切面的一?.5cm處涂上一薄層黑漆以吸收剩余的激發(fā)光。至此，2,4-D檢測生物芯片制備完成。

3 數(shù)據(jù)分析方法

用平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器檢測農(nóng)藥類污染物2,4-D的方法，是建立在間接競爭模式基礎(chǔ)上的，在本研究中，先將小分子配基固定到傳感芯片上，然后將經(jīng)熒光標(biāo)記的抗體和待測樣品中的抗原經(jīng)過進(jìn)樣系統(tǒng)定量混合，使混合溶液預(yù)先預(yù)反應(yīng)一段時間后，再將其通過進(jìn)樣系統(tǒng)輸送到反應(yīng)池進(jìn)行反應(yīng)，此時混合樣品中剩余的帶有熒光標(biāo)記的抗體再與固定在傳感芯片上的抗原結(jié)合，測定系統(tǒng)響應(yīng)信號。在這種檢測模式下，待測樣品中的抗原越多，反應(yīng)后剩余熒光標(biāo)記抗體就會越少，能與固定傳感芯片上的抗原結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體也就越少，系統(tǒng)的檢測響應(yīng)信號就越弱，反之信號就越強(qiáng)，兩者間呈負(fù)相關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線是進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)，也是實(shí)現(xiàn)定量關(guān)系的主要依據(jù)，同時也是驗(yàn)證檢測方法的靈敏度的主要依據(jù)。在本研究中標(biāo)準(zhǔn)曲線是指描述檢測信號值與抗原濃度的關(guān)系曲線，也稱為劑量-效應(yīng)曲線，檢測方法的關(guān)鍵是在以上優(yōu)化檢測條件下，能夠制作具有重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以驗(yàn)證檢測方法的靈敏性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

基于平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器檢測農(nóng)藥類污染物2,4-D的方法是建立在間接競爭模式基礎(chǔ)上的，所以標(biāo)準(zhǔn)曲線是在半對數(shù)坐標(biāo)體系下的反S型曲線，通常可用四參數(shù)的數(shù)學(xué)函數(shù)模型即Logistic模型模擬，可具有很好的效果。

試中，χ—表示標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度（或待沒物質(zhì)的濃度）；

y—表示X對應(yīng)的系統(tǒng)響應(yīng)信號值；

χ0—表示曲線的中點(diǎn)；

A1—是上端漸近線（X=0）；

A2—是下端漸近線（X→∞）；

P—為曲線拐點(diǎn)處斜率。

檢測區(qū)間：也稱有效檢測范圍，指在限定誤差滿足預(yù)定要求的的前提下，特定方法的測定下限至測定上限之間的濃度范圍，在此范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確地定量測定待測物質(zhì)的濃度或量。此處我們定義系統(tǒng)檢測響應(yīng)信號最大值的20%～80%間的區(qū)域?qū)?yīng)的χ值[χ1，χ2]為檢測方法的檢測區(qū)間；

檢測限：檢測限為定量范圍的兩端，分別為測定上限與測定下限。測定上限是在限定誤差能滿足預(yù)定要求的前提下，用特定方法能準(zhǔn)確地定量測定待測物質(zhì)的最大濃度或量，稱為該方法的測定上限，對沒有（或消除了）系統(tǒng)誤差的特定分析方法的精密度要求不同，測定上限也將不同；測定下限是在測定誤差能滿足預(yù)定要求的前提下，用特定方法能準(zhǔn)確地定量測定待測物質(zhì)的最小濃度或量，稱為該方法的測定下限，它能準(zhǔn)確反映出分析方法能定量測定低濃度水平待測物質(zhì)的極限可能性，本研究方法定義系統(tǒng)檢測響應(yīng)信號最大值的95%對應(yīng)的濃度值χ3為檢測方法的檢測下限。

IC50值：定義系統(tǒng)檢測響應(yīng)信號最大值的50%對應(yīng)的濃度值χ0為檢測方法的IC50值，亦稱檢測方法的半抑制濃度。

為了方便,我們通常將檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后再做成標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)過歸一化處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可以對不同批次測定出的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,也可以用于不同傳感芯片繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。歸一化的標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)值用%B/B0比值的形式表示，意義是測定樣品時傳感系統(tǒng)的最大有效響應(yīng)信號值的最大值的比值，且比值在100%（當(dāng)=A1時，上端漸近線）至0%（=A2，下端漸近線）之間，公式為：

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測試

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列測試結(jié)果如圖2和圖3歸一化處理后的儀器檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線及圖4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的模擬參數(shù)表所示。

圖2　系統(tǒng)對2,4-D標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的響應(yīng)情況

從圖2系統(tǒng)對0μg/L、0.5μg/L、3μg/L、8μg/L、30μg/L、50μg/L、80μg/L、100μg/ L、300μg/L、500μg/L，共10個2,4-D標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的響應(yīng)峰可以看出，選用上述優(yōu)化條件：標(biāo)記抗體濃度1.2μg/ml，進(jìn)樣時間300s，預(yù)反應(yīng)時間180s，對濃度為1μg/L、5μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L、10,000μg/L的2,4-D標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測試，系統(tǒng)響應(yīng)成一定的規(guī)律性性梯度。

圖3　歸一化處理后的儀器檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖3歸一化處理后的儀器檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，系統(tǒng)響應(yīng)值對2,4-D標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度可以繪制出一條完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線，說明在上述優(yōu)化條件下，傳感器系統(tǒng)與2,4-D標(biāo)準(zhǔn)系列濃度間是符合Logistic模型的。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的模擬參數(shù)

模擬的符合程度從表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的模擬參數(shù)表中可知，符合度R2=0.9967。在數(shù)據(jù)分析方法中，我們定義系統(tǒng)檢測響應(yīng)信號最大值的20%～80%間對應(yīng)區(qū)域的X值[X1，X2]為檢測方法的檢測區(qū)間，所以在這個優(yōu)化的檢測條件下，檢測的儀器標(biāo)準(zhǔn)曲線模擬得出的定量檢測區(qū)間為9.3～158.6μg/L；定義系統(tǒng)檢測響應(yīng)信號最大值的95%對應(yīng)的濃度值X3為檢測方法的檢測限，曲線模擬得出的該檢測方法的檢出限為1.9μg/L；定義系統(tǒng)檢測響應(yīng)信號最大值的50%對應(yīng)的濃度值X0為檢測方法的IC50值，亦稱檢測方法的半抑制濃度，曲線模擬得出的IC50值為37.28μg/L。

4.2檢測周期與重現(xiàn)性測試

我們對平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器檢測農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)過在優(yōu)化條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲繪制，可以明確經(jīng)優(yōu)化的檢測條件下檢測農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D，可以使檢測具有快速簡便性、高靈敏性、準(zhǔn)確性、可靠性等優(yōu)點(diǎn)。本方法一個完整的檢測周期只需15min，比現(xiàn)有的其它儀器分析方法在檢測方法上更簡便，所用檢測周期更短。既可用于實(shí)驗(yàn)室分析方法，也可用于野外應(yīng)急快速檢測方法。

為了檢驗(yàn)傳感芯片的使用期壽命（即芯片的檢測使用周期），在本研究過程中，所有測試過程只使用了一個芯片，經(jīng)過完成整個研究的測試工作后，芯片使用次數(shù)達(dá)到200次。為了研究芯片的實(shí)際使用壽命，對使用了200個檢測周期后的芯片進(jìn)行了19次重復(fù)性和穩(wěn)定性測試，結(jié)果如圖4所示。

圖4　　檢測方法的重現(xiàn)性測試

從圖4檢測方法的重現(xiàn)性測試可以確定，平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器檢測農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D時，用本研究方法修飾的免疫傳感芯片具有多次重復(fù)使用的性能，在使用次數(shù)超過200次后，傳感芯片仍然具有良好的重現(xiàn)性，即穩(wěn)定性。在該檢測條件下重復(fù)測試19次，儀器的精密度可以達(dá)到2.4%，證明本研究方法研制的免疫傳感芯片檢測壽命周期大于200次，在實(shí)際使用過程中一個傳感芯片可以重復(fù)使用200次以上，既可以快速簡便地進(jìn)行檢測，還可以大大節(jié)省檢測費(fèi)用，利于本研究成果在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的普及使用。

4.3檢測精密度及回收率

加標(biāo)回收率的測定是在測定樣品時，于同一樣品的子樣中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測定，將其測定結(jié)果扣除樣品的測定值，以計算回收率。加標(biāo)回收率的測定可以反映測試結(jié)果的準(zhǔn)確度，當(dāng)按照平行加標(biāo)進(jìn)行回收率測定時，所得結(jié)果既可以反映測試結(jié)果的準(zhǔn)確度，也可以判斷其精密度。為了判斷利用平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器檢測農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D方法的準(zhǔn)確度、精密度及回收率，本研究對實(shí)際水樣進(jìn)行了加標(biāo)回收率測試。

樣品加標(biāo)回收率和計算方法：在測定樣品的同時，于同一樣品的平行樣中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測定，將其測定結(jié)果扣除樣品的測定值，以計算回收率，計算公式如下：

回收率（%）=（X2-X1）/X×100%

4.4樣品的采集

為了對實(shí)際水樣進(jìn)行加標(biāo)測試,驗(yàn)證平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器檢測農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D方法的準(zhǔn)確度、精密度及回收率，我們采集清華大學(xué)自來水作為飲用水,清華大學(xué)近春園水樣作為地下水,圓明園水樣作為地表水進(jìn)行了加標(biāo)回收率測試。樣品詳細(xì)信息如表2所示。

表2　　測試樣品情況表

4.5農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D實(shí)際水樣加標(biāo)回收率的測試與討論

測試條件：帶標(biāo)記的2,4-D抗體濃度1.2mg/ ml；進(jìn)樣時間選擇設(shè)置上述優(yōu)化后的進(jìn)樣時間300s（即5min），預(yù)反應(yīng)時間設(shè)置為上述優(yōu)化時間180s（3min）。

（1）水樣的測定：在上述條件下對水樣進(jìn)行設(shè)置平行測試3次，記錄測試結(jié)果。

（2）同一水樣分取平行雙樣，分別加入2,4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液，使平行雙樣中2,4-D濃度分別為1μg/L及2μg/L，對每個加標(biāo)水樣設(shè)置平行測試3次，記錄測試結(jié)果。

實(shí)際水樣的檢測結(jié)果及水樣加標(biāo)回收測試結(jié)果如表3農(nóng)藥類污染物2,4-D的實(shí)際樣品測試結(jié)果所示。

表3　農(nóng)藥類污染物2,4-D的際樣品測試(平行測試次數(shù)n=3)

從表3中可以看出，水樣中含2,4-D濃度都低于最低檢測限1.9μg/L，可以認(rèn)為水樣中未檢出農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D。所有水樣的加標(biāo)回收后，加標(biāo)回收率在88%～111%區(qū)間，所有水樣檢測的變異系數(shù)都小于10%，表明基于平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器的農(nóng)藥類污染物2,4-D的檢測方法具有很好的精密度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性，可以確定，平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器檢測農(nóng)藥類小分子污染物2,4-D檢測方法是有效可行的。

5 結(jié)論

為了確保平面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器對2,4-D的檢測方法的準(zhǔn)確性和可靠性，在經(jīng)過優(yōu)化的檢測條件下，對方法的檢測性能從檢測曲線的繪制、實(shí)際樣品的測試、實(shí)際樣品中加標(biāo)回收率的測試、對使用了200次測試周期的傳感免疫芯片進(jìn)行重復(fù)性測試等方面進(jìn)行了檢測方法的性能檢驗(yàn)性研究。

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果說明，本檢測方法傳感器系統(tǒng)與2,4-D標(biāo)準(zhǔn)系列濃度間是符合Logistic模型的，模擬的符合程度符合度R2=0.9967，定量檢測區(qū)間為9.3～158.6μg/L；方法的檢出限為1.9μg/L；半抑制濃度IC50值為37.3μg/L。

2.對測試過200次后的傳感芯進(jìn)行的重復(fù)性測試結(jié)果表明，傳感芯片經(jīng)過200次以上的周期后，儀器的精密度仍可達(dá)到2.4%，表明本方法研制的免疫傳感芯片可以重復(fù)使用檢測200次以上，既可以快速簡便地進(jìn)行檢測，還可以大大節(jié)省檢測費(fèi)用，利于本研究成果在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的普及使用。

3.加標(biāo)回收率測試結(jié)果說明，方法的加標(biāo)回收率在88%～111%區(qū)間，且水樣檢測的變異系數(shù)小于10%，檢測方法具有很好的精密度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性，可以確定，檢測方法是有效可行的。

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The Planar Waveguide Florescence Immuno-sensor (PWFI) is a kind of high sensitive bio-sensor which based on the principles of Total Internal Ref ection Fluorescence and Immunoassay. This paper introduces to establish a detection method of small molecules pesticide pollutant-2,4-D by using PWFI bio-sensor. This method can be used to the rapid detection and early warning of pesticide pollutions as a support to the protection of water environment.