響應(yīng)曲面法優(yōu)化石榴皮總黃酮提取工藝

鄧婷婷,李建華,肖本勝,鄭琦鍇,宋 陽

(湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 湖北 孝感 432000)

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響應(yīng)曲面法優(yōu)化石榴皮總黃酮提取工藝

鄧婷婷,李建華*,肖本勝,鄭琦鍇,宋 陽

(湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 湖北 孝感 432000)

為獲得超聲波輔助提取石榴皮總黃酮的最佳工藝條件，在采用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出影響石榴皮總黃酮提取量的關(guān)鍵因素，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定這些因素中心值的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.0.6軟件中心復(fù)合試驗(yàn)(Central Composite Design，CCD)模塊進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，初始溫度和提取時(shí)間在研究所設(shè)水平范圍內(nèi)對石榴皮總黃酮提取影響不顯著；以石榴皮總黃酮提取量最大值作為優(yōu)化目標(biāo)，在室溫下提取10 min，得到石榴皮總黃酮最佳提取工藝條件為：液料比(mL/g)82：1，乙醇分?jǐn)?shù)66%，超聲波功率154 W；在此條件下進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮平均提取量為165.10 mg/g，達(dá)到理論預(yù)測值(171.22 mg/g)的96.42%，表明該工藝條件穩(wěn)定可靠，提取率高，可作為從石榴皮中大規(guī)模提取總黃酮的參考。

石榴皮；總黃酮；響應(yīng)曲面法；Design-expert軟件

本研究在運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)初步確定影響石榴皮總黃酮提取量的主要因素及其水平范圍的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化石榴皮總黃酮超聲波輔助提取工藝，為簡便高效提取石榴皮總黃酮提供參考，為后續(xù)純化及測定總黃酮成分等研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮石榴采自湖北省孝感市楊店果園，將剝下的石榴皮置于60 ℃烘箱內(nèi)干燥20 h，粉碎過40目篩備用；安捷倫 Cary 60 紫外-可見分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司)；循環(huán)水真空泵(SHZ-III型，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(PL203型，梅特勒-托利多儀器有限公司)；智能超聲波清潔器(DL-480B型，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型，江蘇榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

植物提取物中總黃酮的測定一般采用亞硝酸鹽-硝酸鋁法[5-7]，但紫外分光光度法測定植物提取物中總黃酮更簡單、 準(zhǔn)確[8]。本研究參考王靜等[10]的研究結(jié)果，以山奈酚為對照品，在265 nm波長下測定其吸光值，構(gòu)建總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體的作法是：精確稱取3.4 mg山奈酚對照品，用20 mL甲醇超聲(功率：240 W，時(shí)間：5 min)溶解，得每1 mL含0.170 mg山奈酚的儲備液。分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL儲備液，用75%乙醇稀釋為10 mL，搖勻，配制成濃度梯度0.0085～0.051 mg/mL的山奈酚工作液，以 75%乙醇為空白對照，在265 nm處測定不同濃度山奈酚溶液的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.2 總黃酮的提取與檢測

準(zhǔn)確稱取石榴粉(過40目篩)0.5 g后，按設(shè)定的工藝參數(shù)進(jìn)行超聲波提取和真空抽濾，得到石榴皮總黃酮提取液。用移液器準(zhǔn)確量取5 μL石榴皮總黃酮提取液，置于10 mL具塞試管中，加5 mL 75%乙醇搖勻，在265 nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程和液料比，計(jì)算出每克石榴粉中總黃酮的提取量。

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)以往研究經(jīng)驗(yàn)，選取可能對超聲波法黃酮提取率有影響的5個(gè)因素(初始溫度、提取時(shí)間、液料比、乙醇分?jǐn)?shù)、超聲波功率)，每個(gè)因素取兩個(gè)水平(低水平“-1”和高水平“+1”) 進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定顯著影響石榴皮總黃酮提取量的因素。需說明的是，由于在提取過程中超聲波清洗器中的水溫會(huì)不斷變化，不易測定，故將其初始溫度作為一個(gè)變量。表1為Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及編碼。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，選取顯著影響石榴皮總黃酮提取量的因素，分別以試驗(yàn)值變化梯度方向?yàn)榕榔路较颍孕?yīng)值的大小為最優(yōu)步長，可得到最優(yōu)提取條件下，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜上，在當(dāng)前階段對于老年糖尿病并發(fā)神經(jīng)痛患者實(shí)施優(yōu)質(zhì)化護(hù)理干預(yù)方式能夠提升患者的護(hù)理效果，改善患者的神經(jīng)痛情況，提高患者的治療依從性。

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central composite design，CCD)，并對石榴皮中總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

以山奈酚為標(biāo)準(zhǔn)品，在265 nm條件下試驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=86.948x- 0.0024，其中y為吸光度，x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，該回歸方程線性決定系數(shù)R2= 0.9997，表明在試驗(yàn)所用濃度范圍內(nèi)，溶液中山奈酚含量與吸光值呈良好的線性關(guān)系。

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2，對表2中Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)及試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)，構(gòu)建回歸方程。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

方差分析結(jié)果(表3)表明，在所研究的5個(gè)因素中，初始溫度和提取時(shí)間對石榴皮總黃酮提取量的影響不顯著(P>0.05)，在后續(xù)研究中將提取初始溫度和提取時(shí)間分別固定為室溫和10 min；而乙醇分?jǐn)?shù)、超聲波功率和液料比對石榴皮總黃酮提取量的影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，本研究選取這3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡和響應(yīng)面試驗(yàn)。由PB試驗(yàn)構(gòu)建的回歸方程為：

總黃酮=23.90071-0.030219×溫度-0.53428×?xí)r間+0.69441×液料比+0.80368×乙醇分?jǐn)?shù)+0.44557×功率。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在上述5個(gè)因素對總黃酮提取量的回歸方程中，乙醇分?jǐn)?shù)、超聲波功率、液料比的系數(shù)為正，故這三個(gè)因素應(yīng)從低水平向高水平進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)在室溫下提取10 min(見表4)。

從表4可知，在第4組試驗(yàn)條件下，石榴皮總黃酮提取量最大，因此應(yīng)以第4組中各因素的試驗(yàn)水平作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即以液料比75:1，乙醇分?jǐn)?shù)70%，超聲波功率134.4 W為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.3 石榴皮總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及提取結(jié)果

在Plackett-Burman試驗(yàn)以及最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比A(mL/g)、乙醇分?jǐn)?shù)B(%)、取整后的超聲波功率C(W)為設(shè)計(jì)參數(shù)，以提取總黃酮含量Y(mg/g)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，在室溫下提取10 min，可得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表5。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，通過Design-Expert 8.0.6軟件對表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及方差分析，得到多元非線性回歸方程為：

Y=147.11+9.55A-4.89B+11.03C-1.99AB-1.36AC-12.19BC-2.48A2-6.88B2-18.38ABC-31.90AB2-2.68B3

式中，Y為石榴皮中總黃酮的提取量(mg/g)，多元回歸方程的方差分析結(jié)果見表6。

該回歸方程的決定系數(shù)(R2)為0.9898，說明該模型擬合度較好，所選試驗(yàn)因子對響應(yīng)值有較大的影響；F檢驗(yàn)表明，模型F=70.4559，對應(yīng)的P<0.0001，表明回歸模型達(dá)到極顯著水平，該模型有意義；失擬項(xiàng)F=0.8966，對應(yīng)P=0.5042>0.05，表明該回歸方程沒有遺漏對響應(yīng)值有顯著影響的項(xiàng)，即方程所含各項(xiàng)可對響應(yīng)值的變化做出較全面的解釋。

2.4 響應(yīng)曲面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件得到的液料比、乙醇分?jǐn)?shù)和超聲波功率兩兩之間交互作用的3D響應(yīng)曲面如圖1所示。圖1中分別反應(yīng)液料比與乙醇分?jǐn)?shù)、液料比與超聲波功率、乙醇分?jǐn)?shù)與超聲波功率交互作用的三個(gè)響應(yīng)曲面均不呈球面，表明乙醇分?jǐn)?shù)、液料比和超聲波功率兩兩之間存在著交互作用，即各因素在其他因素的不同水平上，對石榴皮總黃酮提取量的影響不同；但從響應(yīng)曲面波動(dòng)幅度看，反應(yīng)液料比與乙醇分?jǐn)?shù)、液料比與超聲波功率之間的交互作用不強(qiáng)，乙醇分?jǐn)?shù)與超聲波功率間的交互作用較強(qiáng)；結(jié)合方差分析結(jié)果(表6)，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)主要考慮乙醇分?jǐn)?shù)與超聲波功率之間的互作效應(yīng)以及液料比的主效應(yīng)。

表5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表6 多元回歸方程的方差分析

圖1 因素間的交互作用

2.5 最佳工藝確定與驗(yàn)證

以石榴皮中總黃酮提取率最高為目的，以試驗(yàn)所用液料比、乙醇分?jǐn)?shù)和超聲波功率范圍為條件，用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測，得到石榴皮總黃酮提取工藝的理論最優(yōu)條件：液料比(mL/g)82:1，乙醇分?jǐn)?shù)66%，超聲波功率154 W，其理論預(yù)測值為171.22 mg/g；為檢驗(yàn)最優(yōu)條件的可靠性，在此條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)的總黃酮平均提取量為165.10 mg/g，與理論預(yù)測值相比，預(yù)測的準(zhǔn)確率為96.42%，表明該模型的預(yù)測準(zhǔn)確率較高。

3 結(jié)論

在所研究的可能影響石榴皮總黃酮提取率的5個(gè)因素中，液料比、乙醇分?jǐn)?shù)和超聲波功率對石榴皮總黃酮提取率影響較大，初始溫度和提取時(shí)間在研究所設(shè)水平范圍內(nèi)對石榴皮總黃酮提取影響不顯著。以液料比(mL/g)82:1，乙醇分?jǐn)?shù)66%，超聲波功率154 W為工藝條件，在室溫下提取10 min，得總黃酮的平均提取量為165.10 mg/g。本工藝對提取溫度和提取時(shí)間不敏感，在室溫下提取10 min總黃酮的得率較高，對于從石榴皮中提取總黃酮具有一定的參考價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：熊文濤)

Optimized Extraction Process of Total Flavonoids from Pomegranate Peel by Response Surface Methodology

Deng Tingting, Li Jianhua*, Xiao Bensheng, Zhen Qikai, Song Yang

(SchoolofLifeandScienceTechnology,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

This paper investigated the optimum technological conditions for extracting total flavonoids from pomegranate peel by ultrasound-assisted extraction process. Key factors were selected by Plackett-Burman design, which could influence total flavonoids extraction efficiency from pomegranate peel . Steepest ascent experiment was conducted to determine the optimal level of these factors. The response surfaces were delineated based on the central composite design model in Design-Expert 8.0.6 software. The results showed that the initial temperature and extraction time had no significant effect on the extraction of total flavonoids from pomegranate peel within the scope of the research institute. Extraction at room temperature for 10 min, the optimum extraction conditions were determined to maximize the extraction of total flavonoids from pomegranate peel: the liquid-to-solid ratio (mL/g), the proportion of ethanol and the ultrasonic power was 82:1, 65% and 154 W, respectively. Under this condition, 5 parallel verification tests were carried out and the average value of total flavonoids extraction (165.09 mg/g) reached 96.42% of the theoretical prediction value (171.22 mg/g). It showed that the process was reliable with higher extraction rate, so it could be used as a reference to extract the total flavonoids from pomegranate pee on large scale.

pomegranate peel; total flavonoids; response surface analysis; design-expert software

2016-08-11

湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610528005)；湖北省教育科學(xué)規(guī)劃2015年度立項(xiàng)課題(117)

鄧婷婷(1995- )，女，湖北松滋人，湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)生。

李建華(1969- )，男，湖北孝感人，湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授，博士，本文通信作者。

R284.2

A

2095-4824(2016)06-0020-05