糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內皮細胞中血管內皮細胞生長因子和白細胞介素-1α的影響

蒿長英，陳明霞，馬文斌，郭平，呂海波，劉曄，連增林

1.漢典集團北京紅太陽藥業有限公司，北京 100103；2.北京中醫藥大學，北京 100102；3.漢典集團北京漢典制藥有限公司，北京 100103；4.漢典集團北京漢典中醫研究院有限公司，北京 100103

糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內皮細胞中血管內皮細胞生長因子和白細胞介素-1α的影響

蒿長英1，陳明霞2，馬文斌1，郭平3，呂海波3，劉曄4，連增林4

1.漢典集團北京紅太陽藥業有限公司，北京 100103；2.北京中醫藥大學，北京 100102；3.漢典集團北京漢典制藥有限公司，北京 100103；4.漢典集團北京漢典中醫研究院有限公司，北京 100103

目的 探討糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞EA.hy926中血管內皮細胞生長因子（VEGF）和白細胞介素（IL）-1α基因和蛋白表達的作用機制。方法 人臍靜脈內皮細胞EA.hy926分為空白組、高糖組、全方組、部位1（苷類和黃酮類）組、部位2（有機酸類和多糖類）組和部位3（生物堿類）組。以D-葡萄糖干預細胞復制高糖模型，半定量RT-PCR檢測糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導細胞中VEGF和IL-1α的基因表達；ELISA檢測糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的細胞中VEGF和IL-1α的蛋白表達。結果 高糖導致EA.hy926細胞VEGF和IL-1α mRNA和蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。糖網明目顆粒及其不同提取部位干預細胞后，VEGF和IL-1α基因和蛋白表達顯著降低（P＜0.05），變化幅度依次為：部位1＞部位3＞部位2。結論 糖網明目顆粒中苷類和黃酮類、生物堿類及有機酸類和多糖類調控高糖誘導的血管內皮細胞VEGF和IL-1α表達的作用強度依次減弱。

糖網明目顆粒；糖尿病視網膜病變；人臍靜脈內皮細胞EA.hy926；血管內皮細胞生長因子；白細胞介素-1α

糖網明目顆粒用于治療糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）。本課題前期研究結果表明，糖網明目顆粒能明顯改善糖尿病大鼠視網膜微血管病理學狀態，降低血管生成相關因子的蛋白和基因水平[1-2]。本實驗采用血管內皮細胞高糖模型，進一步探討糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞EA.hy926中血管內皮細胞生長因子（VEGF）和白細胞介素-1α（IL-1α）基因和蛋白表達的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞

人臍靜脈內皮細胞EA.hy 926購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物及提取部位

糖網明目顆粒處方由女貞子、烏梅、黃連、密蒙花、肉桂、黃芪、益母草組成，所用飲片購于安國市萌露中藥飲片有限公司，經北京漢典中醫研究院劉曄老師鑒定，均符合2010年版《中華人民共和國藥典》標準。糖網明目顆粒提取物和不同提取部位由北京漢典中醫研究院有限公司提供，采取醇提、水提相結合方法，將各飲片中的主要藥效物質充分提取，最后經噴霧干燥制成提取物。其中，部位1為黃芪、女貞子、密蒙花提取物，主要含苷類和黃酮類物質；部位2為烏梅、肉桂提取物，主要含有機酸和多糖類物質；部位3為益母草、黃連提取物，主要含生物堿類物質。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；高糖DMEM培養液，Hyclone，SH30022.01B；0.25%胰蛋白酶，Hyclone，SH30042.01B；DMSO，Amresco，0231）；青鏈霉素混合液，Solarbio，P1400-100；C8661-25G；RT-PCR試劑盒（TaKaRa，RR019A），ELISA試劑盒（北京鑫方程生物技術有限公司）。MCO-175二氧化碳培養箱（SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學），DPL-ⅡA型噴霧制粒儀（重慶精工制藥機械有限責任公司），BIOMATE型紫外可見分光光度計（Thermo），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），JY600電泳儀（北京君意東方電子設備有限公司），ChampGel 5000型全自動凝膠成像系統（北京賽智創業科技有限公司），MULTLSKAN MK3酶標儀（Thermo）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養及藥物干預

EA.hy926細胞第3代經胰酶消化，用普通培養液（含10%FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L硫酸鏈霉素的高糖DMEM培養液）稀釋成2.5×104/mL的細胞懸液，將3×106個細胞接種于25 cm2培養瓶中，普通培養液培養24 h后空白組換用普通培養液、高糖組換用D-葡萄糖培養液體外模擬EA.hy926細胞高糖模型，全方組換用D-葡萄糖＋糖網明目顆粒培養液，部位1組換用D-葡萄糖＋部位1培養液，部位2組換用D-葡萄糖＋部位2培養液，部位3組換用D-葡萄糖＋部位3培養液，繼續培養24 h后提取總RNA。

糖網明目顆粒培養液制備：精密稱定糖網明目顆粒提取物0.444 4 g至50 mL離心管中，于超凈臺內加無血清高糖DMEM培養液至40 mL，渦旋震蕩使藥物溶解，靜置30 min后混勻，5000 r/min離心20 min，吸取上清液，用0.45 μm濾器無菌條件下過濾，加入4.44 mL FBS，混勻制成貯存液，封口，于4 ℃冰箱內保存備用。此時，貯存液含糖網明目顆粒提取物濃度為10 mg/mL，含10%FBS。臨用時將貯存液梯度稀釋至所需濃度2.5 mg/mL。其中，各提取部位按照其所占處方比例、提取率折算，相當于全方劑量，工作液配制方法同糖網明目顆粒全方。

D-葡萄糖培養液的制備：精密稱定D-葡萄糖0.459 0 g至36 mL高糖DMEM培養液中，混勻溶解，過濾，加4 mL FBS，混勻，4 ℃封口保存。此時含葡萄糖100 mmol/L，10%FBS。臨用時用相應液體稀釋至40 mmol/L，混勻，進行細胞干預。

2.2 高糖細胞相關基因表達檢測

細胞分組及藥物干預同“2.1”項。藥物干預24 h后，按照試劑盒說明書提取總RNA，以紫外分光光度法測定其濃度，檢測其質量。按照試劑盒說明書進行反轉錄PCR反應，條件為：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35個循環后轉為4 ℃保存。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測上述反應產物，用Lane ID凝膠圖像分析軟件對PCR產物進行半定量分析測定，基因表達水平以β-actin為參比。PCR引物由北京賽百盛公司合成，詳見表1。

表1 基因引物序列

2.3 高糖細胞相關蛋白表達檢測

細胞分組及藥物干預同“2.1”項。藥物干預24 h后，吸取細胞上清液至預冷的1.5 mL無菌EP管中，同組混勻，封口，-80 ℃保存備用。標準品按照說明書稀釋好5個梯度，各梯度每孔加樣量均為50 μL。分別設空白孔、待測樣品孔，每組3個復孔。向待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，混勻。封板膜封板后于37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液重復洗5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL。封板膜封板后37 ℃溫育30 min，如前法重復洗5次，拍干。每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。于450 nm波長處依序測各孔吸光度值（OD值）。以標準物濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，計算直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

3 統計學方法

4 結果

4.1 糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內皮細胞中血管內皮細胞生長因子基因表達的影響

實驗結果顯示，血管內皮細胞高糖誘導24 h后，VEGF基因表達水平顯著上調（P＜0.05）；經藥物干預24 h后，糖網明目顆粒全方組、部位1組和部位3組VEGF基因表達水平顯著下調（P＜0.05），作用強弱順序為：部位1組＞全方組＞部位3組；而部位2組顯著上調（P＜0.05）。提示在抑制因高糖導致的血管內皮細胞VEGF基因表達上調方面，糖網明目顆粒中部位1與部位3發揮了主要作用，而部位2未發揮與糖網明目顆粒全方相同的抑制作用。結果見圖1。

4.2 糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內皮細胞中血管內皮細胞生長因子蛋白表達的影響

實驗結果顯示，血管內皮細胞高糖誘導24 h后，VEGF蛋白表達水平顯著增高（P＜0.05）；經藥物干預24 h后，糖網明目顆粒全方組、部位1組和部位3組VEGF蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），作用強弱為：部位1組＞全方組＞部位3組；而部位2組顯著上調（P＜0.05）。提示在抑制因高糖導致的血管內皮細胞VEGF蛋白表達方面，糖網明目顆粒中部位1和部位3發揮了主要作用，而部位2則未發揮與糖網明目顆粒全方相同的抑制作用。結果見圖2。

圖1 各組血管內皮細胞VEGF基因表達（±s，n＝3）

4.3 糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內皮細胞中白細胞介素-1α基因表達的影響

實驗結果顯示，血管內皮細胞高糖誘導24 h后，IL-1α基因表達水平顯著上調（P＜0.05）；經藥物干預24 h后，糖網明目顆粒全方組及各部位組IL-1α基因表達水平均顯著下調（P＜0.05），作用強弱為：部位1組＞部位3組＞部位2組＞全方組。提示在抑制由于高糖導致的血管內皮細胞IL-1α基因表達方面，糖網明目顆粒各部位作用強度為：部位1＞部位3＞部位2。結果見圖3。

圖2 各組血管內皮細胞VEGF蛋白表達（±s，n＝3）

圖3 各組血管內皮細胞IL-1α基因表達（±s，n＝3）

4.4 糖網明目顆粒不同提取部位對高糖誘導的血管內皮細胞中白細胞介素-1α蛋白表達的影響

實驗結果顯示，血管內皮細胞高糖誘導24 h后，IL-1α蛋白表達水平升高（P＜0.05）；經藥物干預24 h后，糖網明目顆粒全方組及各部位組IL-1α蛋白表達水平均顯著下調（P＜0.05），作用強弱為：全方組＞部位1組＞部位3組＞部位2組。提示，在抑制由于高糖導致的血管內皮細胞IL-1α蛋白升高方面，糖網明目顆粒各部位的作用強度為：部位1＞部位3＞部位2。結果見圖4。

圖4 各組血管內皮細胞IL-1α蛋白表達（s，n＝3）

5 討論

DR是糖尿病微血管病變中主要的眼部并發癥，其致盲的主要原因是由于新生血管引起反復的玻璃體出血和最終的牽引性視網膜脫離等一系列并發癥[3]。高血糖是糖尿病最基本的病生理狀態，亦是導致內皮功能紊亂的根本原因。糖尿病血管內皮細胞功能紊亂被認為是糖尿病血管并發癥發生發展的起始步驟[4]。研究表明，高血糖通過氧化應激導致血管內皮細胞損傷和循環中內皮祖細胞數目下降且功能障礙，從而導致糖尿病傷口難以愈合、缺血心肌冠脈側枝形成不良[5]。而VEGF是目前所知最強的內皮細胞選擇性促有絲分裂肽和血管生成因子，與受體結合后，可刺激血管內皮細胞增殖及移行、細胞外基質變性，誘導新生血管的形成。其病理改變在本質上均是體內動態平衡的失調，血管刺激因素增強和／或抑制因素減少使兩者平衡失調，最終引起新生血管生成。康氏等[6]臨床觀察顯示，DR程度與血清VEGF含量直接正相關，提示血清VEGF含量測定可作為判定DR病變程度的參考指標。IL-1可能是視網膜炎癥引起血視網膜屏障損害的重要因子，其可引起多核細胞和單核細胞向視網膜血管外遷移，血清蛋白向玻璃體內彌散及紅細胞向玻璃體內滲漏等，造成視網膜血管內皮細胞間出現許多大裂隙，使血-視網膜屏障出現缺損，導致局部水腫、滲出、出血和細胞浸潤，其對腫瘤壞死因子-α促進新生血管形成的效應也具有協同作用[7-8]。

本實驗結果顯示，糖網明目顆粒不同提取部位能不同程度地抑制高糖誘導的血管內皮細胞中VEGF和IL-1α基因和蛋白表達，其中以部位1作用最明顯，部位3次之，部位2無此作用或作用不明顯，這與DR發病機制和糖網明目顆粒組方規律一致。DR病機是氣陰兩虛，方中黃芪補氣，女貞子補肝腎明目，密蒙花清熱養肝、明目退翳，這3味藥在方中比例較大，補氣益肝腎，從根本上調理DR病程中之氣陰兩虛狀態。另外，氣虛致氣血瘀滯；陰虛生熱，煎熬津液，精虧液少，血黏不暢。方中益母草活血調經、利尿消腫，黃連清熱燥濕、瀉火解毒，而此2味藥所含有的生物堿類物質如黃連素又有一定的抗炎作用，兩者共用，能調理DR病程中陰虛夾熱之瘀滯狀態，改善DR病程中炎癥反應。烏梅收斂生津止血，與黃芪配伍補氣養血；肉桂補火助陽活血，與黃連配伍，水火既濟，安神寧血，二者若單獨使用，從本實驗結果看藥效不明顯。

綜上，在調控因高糖導致的血管內皮細胞VEGF和IL-1α基因和蛋白表達升高方面，糖網明目顆粒各部位作用強度為：部位1（苷類和黃酮類）＞部位3（生物堿類）＞部位2（有機酸和多糖類）。提示糖網明目顆粒及其不同提取物通過調控高糖狀態下血管內皮細胞的VEGF和IL-1α基因和蛋白表達，從而抑制視網膜新生血管形成和改善視網膜局部水腫、滲出、出血和細胞浸潤狀態，進而達到防治DR的目的。

[1] 蒿長英,陳明霞,郭平,等.糖網明目顆粒對糖尿病大鼠視網膜病變的防治作用及機制研究[J].中國中醫藥信息雜志,2015,22(1)：62-66.

[2] 蒿長英,陳明霞,郭平,等.糖網明目顆粒提取物對缺氧/高糖狀態下血管內皮細胞腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1α表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2015,22(8)：58-62.

[3] 朱洪麗.血管內皮細胞生長因子(VEGF)與增殖型糖尿病視網膜病變相關性的研究[D].沈陽：中國醫科大學,2008.

[4] 劉慧,王小軍,胡榮,等.星形膠質細胞[J].生理科學進展,2004,35(1)：86-91.

[5] PORTER J T, McCARTHY K D. Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals[J]. J Neurosci, 1996,16(16)：5073-5081.

[6] 康前雁,楊玉,王玉琴,等.糖尿病視網膜病變與血清VEGF含量的相關性[J].西安交通大學學報(醫學版),2003,24(4)：392-393,402.

[7] KON C H, OCCLESTON N L, ANYLWARD G W, et al. Expression of vitreous cytokines in proliferative vitreoretinopathy：a pospective study[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40：705-712.

[8] CLAUDIO L, MARTINEY J A, BROSNAN C F. Ultrastructural studies of the blood-retina barrier after exposure to interleukin-1 beta or tumor necrosis factor-alpha[J]. Lab Invest,1994,70：850-861.

Effects of Different Extracts of Tangwang Mingmu Granules on High Glucose Induced VEGF and IL-1α Expressions in Vascular Endothelial Cells

HAO Chang-ying1, CHEN Ming-xia2,

MA Wen-bin1, GUO Ping3, LV Hai-bo3, LIU Ye4, LIAN Zeng-lin4(1. Beijing Red Sun Pharmaceutical Co., Ltd., Handian Group, Beijing 100103, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 3. Beijing Handian Pharmaceutical Co., Ltd, Handian Group, Beijing 100103, China; 4. Beijing Handian Academy of Chinese Medicine, Handian Group, Beijing 100103, China)

Objective To observe the mechanism of action of different extracts of Tangwang Mingmu Granules on high glucose induced VEGF and IL-1α gene and protein expressions in vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells EA.hy926 were divided into six groups: blank, high glucose, Tangwang Mingmu Granules, extract 1 (glycoside and flavonoid), extract 2 (organic acid and polysaccharides) and extract 3 (alkaloids) groups. High concentration glucose was used to establish the high glucose model in EA.hy926 cells. The expressions of VEGF and IL-1α mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. The contents of VEGF and IL-1α protein were tested by ELISA. Results The gene expression and protein levels of VEGF and IL-1α were significantly up-regulated under the high glucose condition (P<0.05). However, the above indicators were significantly reduced after the treatment of Tangwang Mingmu Granules. The activity of different parts of Tangwang Mingmu Granules was as follows: extract 1> extract 3> extract 2. Conclusion The action intensity of glycosides and flavonoids, alkaloids, organic acids and polysaccharides on VEGF and IL-1α expression in Tangwang Mingmu Granules weakens in sequence.

Tangwang Mingmu Granules; diabetic retinopathy; human umbilical vein endothelial cells EA.hy926; VEGF; IL-1α

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.013

R285.5

A

1005-5304(2016)01-0056-04

2015-04-14)

(

2015-10-21；編輯：華強)

北京市科技計劃“十病十藥”研發項目（Z121102001112007）

連增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com