轉抗旱基因IrrE玉米材料的獲得及抗性鑒定

余桂容，張 維，杜文平，宋 軍，陳 謙，徐利遠*

(1.四川省農業科學院生物技術核技術研究所，四川 成都 610066；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081)

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轉抗旱基因IrrE玉米材料的獲得及抗性鑒定

余桂容1，張 維2，杜文平1，宋 軍1，陳 謙1，徐利遠1*

(1.四川省農業科學院生物技術核技術研究所，四川 成都 610066；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081)

以優良玉米自交系綜31的幼胚為受體材料, 采用農桿菌介導法將來自微生物耐輻射奇球菌(Deinococcusradiodurans)的抗旱基因IrrE轉入玉米幼胚組織細胞中, 轉化后的細胞通過抗性篩選, 分化再生成苗。結果表明，經特異PCR檢測，42株植株轉入了IrrE基因，有29株收獲種子。T1代在溫室大棚控制水肥試驗及脯氨酸等生理生化指標檢測表明, 轉基因植株具有良好的耐旱特性, 為抗旱玉米新品種選育提供了較好的親本材料。

玉米幼胚; 遺傳轉化; 抗旱鑒定;IrrE基因

玉米已成為我國的第一大糧食作物，種植面積達到0.2×108hm2，在國民經濟中占有舉重輕重的地位。近年來，由于人口增長，水資源污染，水源利用率低，溫室效應等原因，再加上水資源本身就有限，使得水資源日益緊缺，我國每年受干旱危害面積達2×107hm2，干旱嚴重制約了我國農業的可持續性發展。大量研究表明選育優良抗逆作物新品種是提高作物的產量、改善品質、增強作物抵御不良環境的根本途徑。轉基因育種技術與傳統育種技術相比，縮短了育種周期，不同來源(動植物、微生物)基因整合到宿主植物中，拓寬了作物遺傳改良中可利用的基因資源能提高植物抗逆性能的基因。因此，通過基因工程手段進行玉米抗旱基因重組，進行轉基因抗旱育種，培育出對干旱有更強適應能力的品種，是當前追求的一個十分重要的目標，也是目前國內外同行研究的熱點問題。

植物抗逆抗旱有多種機制，IrrE是一個與抗逆相關的全局性調控蛋白。美國Battista實驗室的Earl和日本Narumi實驗室的Hua先后報道了從D.radiodurans中分離得到編碼D.radiodurans特有蛋白DR0167的基因，命名為IrrE和pprl。該基因的缺失會引起D.radiodurans電離輻射抗性的顯著下降[1-2]。進一步研究發現，IrrE是該菌的DNA損傷修復的總開關蛋白，蛋白組學研究顯示該蛋白還具有總體調控脅迫響應、能量代謝、轉錄調控、信號傳遞等作用[3]。中國農科院林敏、潘婕等研究發現，除了能有效提高大腸桿菌的輻射抗性和氧化抗性外，IrrE還能夠增強大腸桿菌的抗逆性能以及植物的耐鹽能力[4]。他們選用在十字花科植物中耐鹽性較高的甘藍型油菜為研究材料，轉基因當代的油菜經 350 mM 的NaCl的鹽脅迫處理，能正常開花、結實。后代經PCR 的檢測，Southern 雜交實驗證實IrrE基因能在后代中遺傳，并且基本符合孟德爾規律(3∶1)。經Northern 雜交實驗證明IrrE基因能在后代中表達。經 350 mM 的NaCl的鹽脅迫，仍能正常開花、結實，其農藝性狀沒有發生變化。同時，還對轉IrrE基因油菜進行了初步的抗旱實驗，轉基因油菜能存活，并且復水后轉基因油菜能開花、結實[5]。這一初步結果研究證明IrrE蛋白不但能提高宿主的耐鹽性能，還能大幅度增加宿主的耐干旱能力，在轉基因耐鹽、抗旱作物研究上擁有巨大的潛力。

本試驗運用IrrE基因即抗旱基因構建高效表達載體，通過農桿菌介導法將重組載體轉入玉米自交系綜31的幼胚，試圖獲得玉米轉基因植株，再經過田間表型及生理生化檢測等抗旱性鑒定，篩選出抗旱的轉基因玉米材料，為抗旱玉米新品種的育種創制基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉基因受體材料玉米自交系綜31:由中國農科院作物所王國英老師課題組提供后自行繁育的種子。

1.2 植物表達載體構建及玉米轉化

抗旱基因IrrE及其載體pRADZ3由中國農科院生物所林敏老師課題組提供，轉化方法參照文獻[6]。

1.3 轉基因苗的分化再生及PCR鑒定

設計IrrE基因PCR引物序列如下：Z3-irrE1-do:5′ TACATATGGTTCACTGTGCAGCGTC 3′

Z3-irrE2-up:5′ TAACTAGTATGGGGCCAAAAGCTAAAG 3′。

PCR退火溫度52 ℃，延伸時間為1 min，擴增片段951 bp(IrrE全長片段1005 bp)。

1.4 T1代轉基因幼苗的梯度量化控水試驗

溫室大棚內，中度脅迫(盆栽土壤含水量為田間最大持水量40 %左右，試驗田土壤田間最大持水量為25 %)。選擇15份玉米抗旱轉IrrE基因材料

(T1～T15)和1個非轉基因的對照材料(CK)從苗期至開花期對盆缽進行控水，植株以中午萎蔫，早晚舒展為度，作為控水和調查處理標準。控水后開始量化復水，通過反復干旱控制水分觀察苗期萎焉程度及進行相關生理指標測定。

1.5 抗旱生理指標測定

1.5.1 脯氨酸含量測定 待試驗材料幼苗長至5葉期時進行干旱處理,待對照品種萎蔫無法自然恢復時,統一供水恢復,分別采集各品種干旱處理前、后(間隔7 d)的葉片,進行脯氨酸含量測定，通過茚三酮法[7]。先做脯氨酸測定的標準曲線，按照公式y=0.056x+0.024(R2=0.992)，y為脯氨酸含量(μg/g),x為吸光度值進行換算。

1.5.2 玉米開花-抽絲時間間隔(ASI)測定 在抽雄吐絲期開進行田間調查，記錄雌雄穗開花間隔時間。

1.5.3 綠葉面積和株高 在抽雄吐絲期用卷尺測量整株玉米綠葉面積并且記錄數據，利用公式：葉面積 = 葉長 × 葉寬 × 0.75 計算單片葉面積，然后求和得到整株葉面積。成株期測定株高。每個材料選取其中 5株求其平均值。

1.5.4 產量性狀 每個材料選取其中 5個果穗，考查每穗穗長、穗粒數、百粒質量、籽粒曬干后采用 DA7200型近紅外光譜儀測定籽粒含水量，將含水量統一折算為 14 %計算單株穗粒質量。

2 結果與分析

2.1 T0代玉米轉基因苗的分化再生及PCR鑒定

通過農桿菌介導轉化抗旱基因IrrE至玉米自交系綜31的幼胚中，經恢復、篩選、分化再生出轉化苗如圖1，移栽成活后取其幼葉提取DNA進行PCR驗證結果如圖2，將PCR驗證為陽性苗的植株精心栽培，收獲T0代轉化穗子如圖3。

圖1 抗旱基因IrrE轉化玉米幼胚再生苗Fig.1 Regenerated plants from the drought- resistant gene IrrE transformed maize immature-embryos

M為MARKER，1～8為轉化苗，其中1～5和8是陽性苗，6和7為陰性苗M: MARKER, 1-8: The transgenic corn seedlings, including 1-5 and 8 were positive seedlings, 6 and 7 were negative seedlings圖2 轉抗旱基因IrrE玉米苗PCRFig.2 PCR result of drought-resistant gene IrrE transgenic corn seedlings

圖3 轉抗旱基因IrrE玉米T0代穗子Fig.3 Ear of drought-resistant gene IrrE transgenic T0 corn

2.2 T1代轉基因幼苗的梯度量化控水抗旱表現

溫室大棚內，通過反復干旱及量化控制復水試驗檢測表明, 從外形萎焉度可以直觀地看出轉基因植株具有良好的耐旱特性(圖4)。不同的轉化事件T1代抗性表達量不一樣，根據萎焉比例和程度不同，可分為高抗，中抗和敏感(同等情況下復水時不能完全恢復的材料為敏感)，見表1。

2.3 轉基因玉米材料的抗旱生理指標測定

2.3.1 脯氨酸含量測定 將表1中不同抗性程度的轉基因玉米材料分別選取2份作為代表來進行生理指標測定。T3，T4作為高抗代表，T2，T14作為中抗的代表，T13,CK作為敏感的代表。

葉片脯氨酸含量明顯升高(表2)，其中通過葉片萎焉度篩最抗的T3材料升高最多，達到38.5 ng/g，可以看出越是抗旱轉基因株系的葉片中積累了更多的溶質，具有較強的滲透調節能力，可以減輕滲透脅迫對玉米造成的傷害，脯氨酸屬于滲透保護物質。這與前人研究的玉米脯氨酸含量增加越多，則判定玉米品種的抗旱性越強的結論是一致的[8]。

CK為非轉基因的野生型，其余為轉基因T1代CK: Non-transformed wild-type gene, the rest of transgenic T1圖4 T1代轉抗旱基因IrrE玉米苗抗旱分離情況Fig.4 Drought-resistance separation of T1

抗旱性表型(萎焉度)Drought?resistancephenotype(wiltdegree)材料代號MaterialNo．高抗HighresistanceT3，T4，T8，T6，T11，T12中抗ModerateresistanceT2，T14，T9，T5，T15，T10，T7，T1敏感SensitiveT13，CK

2.3.2 轉基因玉米開花-抽絲時間間隔(ASI)測定 玉米的抽雄吐絲期是玉米對水分需求最為關鍵的時期即需水臨界期，在這個時期對干旱脅迫非常敏感(表3)，如果在抽雄吐絲期受到干旱脅迫會使玉米雌花抽絲延遲，雄花的花粉活力降低，最終導致產量下降。從表3可見,抗旱性越好的材料ASI越短，T3只有2 d左右，而對照高達5.5 d。

2.3.3 綠葉面積和株高 干旱脅迫對玉米植株光合作用的影響表明，轉抗旱基因抗性較強的植株在干旱脅迫下長勢更好，株高較高，有較好的光合作用。玉米在受到干旱脅迫時，由于水分的喪失或供給不足，在形態上首先表現在葉片上，即抑制葉片生長是玉米葉片難以伸展，造成玉米葉片面積的減小，進而影響到其他的方面，最終造成減產。由表4可見，抗旱性越好的轉基因材料，在株高和綠葉面積方面的優勢越強。

表2 干旱脅迫對玉米葉片脯氨酸含量的影響

表3 干旱脅迫對玉米轉基因材料開花-抽絲時間間隔(ASI)的影響

表4 干旱脅迫對不同玉米轉基因材料綠葉面積和株高的影響

2.3.4 產量性狀 非轉抗旱基因的玉米對照的籽粒產量明顯比轉基因的籽粒產量降低，不同轉基因玉米材料間產量及其受干旱影響的程度有較大差異。玉米的產量是生產上的重要指標，通過對籽粒產量的獲得與分析，可以直觀的得到一定的結果，從而判斷玉米材料的抗旱性。在缺水情況下，玉米的生長發育受到一定的限制，最終表現在產量上。在不同水分脅迫下，玉米由于受到干旱脅迫導致最終產量的差異(表5)。單株平均產量表明最抗的材料比對照增產20 g左右。

3 討 論

通過轉基因作物獲得的耐旱性狀被看作是全球轉基因作物商業化的第2個10年內(2006年至2015 年) 及將來能夠獲得商業化的最重要的性狀，因為到目前為止，耐旱性是提高全球作物產量的一個最重要的制約因素。2013年，孟山都公司已在美國推出第一種也是最先進的生物技術轉基因耐旱玉米[12]。

外形萎焉度等形態指標是一種利用作物長勢、長相來進行作物缺水診斷的定性方法。由于作物生長對水分虧缺比較敏感，可以采用經驗方法，根據作物的長勢、長相來進行作物旱情診斷,作物形態指標直觀，觀測方便。干旱時卷葉程度也是抗旱的形態結構指標之一。作物在水分脅迫下有自我調節能力，水分虧缺下作物的細胞膨壓降低而產生卷葉，葉片卷曲程度在不同玉米品種間有明顯差異,因此可用于鑒別抗旱性強弱。葉片卷曲程度可以作為玉米的重要抗旱性指標[9]。

脯氨酸是目前所知分布最廣的滲透保護物質,動物、植物、真菌、藻類中都有脯氨酸的累積。在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍、紫外線以及重金屬等),脯氨酸合成的增加會導致植物體內脯氨酸大量累積,植物通過提高體內脯氨酸的含量調節滲透平衡,從而保護細胞的結構,很多實驗證明脯氨酸的累積與植物對環境脅迫的耐受能力正相關[8，10-11]，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸，因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標。

玉米的抽雄吐絲期是玉米對水分需求最為關鍵的時期即需水臨界期，如果玉米在抽雄吐絲期受到干旱脅迫的話，玉米的雌穗生長受到抑制，使其生長速率減慢、雌穗短小、苞葉緊縮、雌絲不能正常吐出，推遲了吐絲的時間，玉米的雄花也會因為干旱脅迫而難以散粉，或者造成花粉活力降低，延誤了散粉的時機。這樣會使抽雄吐絲間隔期增大，進一步使玉米結實率、千粒重和籽粒產量等下降。開花期具有時間短，兼顧營養和生殖生長階段，對水分脅迫敏感，重復性強，易于活體鑒定，在進行抗旱篩選時玉米的抽雄吐絲間隔期可作為重要的指標進行選擇分析。

本實驗研究立足于我國西南地區的氣候生態特點和干旱對玉米生產及增產的影響，綜合國內外玉米抗旱研究的現狀和趨勢，以多個轉基因玉米自交系為材料，采用人工控水處理進行抗旱鑒定試驗，綜合多個抗旱評價指標，對不同玉米材料進行生長發育、形態、生理生化的研究與評價，鑒定出一批抗旱性較強的轉基因玉米自交系材料，為抗旱性玉米品種選育提供一定幫助，也是研究抗旱性玉米品種的基礎與前提。更多抗旱性玉米材料的創制和改良以及抗旱轉基因玉米品種的選育與應用有待進一步研究。

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(責任編輯 陳 虹)

Transgenic Drought-resistant GeneIrrEMaize Material Obtaining and Resistance Identification

YU Gui-rong1, ZHANG Wei2, DU Wen-ping1, SONG Jun1, CHEN Qian1, XU Li-yuan1*

(1.Institute of Biotechnology & Nuclear Techniques, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066, China; 2.Biotechnology Research Institute, China Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Taken the maize inbred‘Zhong-31’as the transgenic receptor, the drought- resistant gene(IrrE) fromDeinococcusradioduransbyAgrobacterium- mediated was transformed into the immature-embryos of Zhong-31, its immature-embryos were screen out,differentiated and regenerated plants. The result showed thatIrrEin 42 transgenic plants from initial regenerated plants by PCR detection were identified, of which the seeds of their 29 plants were harvested. Based on the regulation of water and nutrients, the analysis of proline, and so on for T1, the results indicated that transgenic plants had well drought-resisting characters, which provided a good parent plants for drought resistant breeding of maize.

Maize immature-embryo; Transgenic; Drought- resistance identification;IrrEgene

1001-4829(2016)08-1782-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.005

2015-09-08

轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0800301B)；四川省農科院財政基因工程項目(2011JYGC01-002)；四川省農科院高新技術研究應用專項(2013GXJS-001)

余桂容(1971 -),女，四川榮縣人， 副研究員,主要從事玉米基因工程育種，*為通訊作者: 徐利遠, 研究員, 主要從事農作物遺傳育種研究，E-mail: yuguirong@163.com。

S513

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