黃瓜霜霉病菌對甲霜靈的抗藥性

祝海娟，劉大偉，張艷菊，白玲玲，楊佳樂

(東北農業大學農學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

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黃瓜霜霉病菌對甲霜靈的抗藥性

祝海娟，劉大偉，張艷菊*，白玲玲，楊佳樂

(東北農業大學農學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

本研究采用葉盤漂浮法測定了來自黑龍江省、吉林省、遼寧省、北京、山東省、江蘇省、湖北省和廣東省8個省份13個黃瓜主產區的36個黃瓜霜霉病菌株對甲霜靈的抗藥性。結果表明，黃瓜霜霉菌對甲霜靈的EC50值為1.3277～171.5480 μg/mL，平均EC50值為64.6782 μg/mL；36株菌株中，有3個中抗菌株，占總菌株數的8.3 %；33個高抗菌株，占91.7 %，為優勢群體，無敏感菌株和低抗菌株。各地區采集的黃瓜霜霉菌對甲霜靈抗性水平范圍28.25～3649.96倍，平均抗性水平為1376.13倍；除黑龍江省齊齊哈爾檢測到1株中抗菌株和遼寧省海城檢測到2株中抗菌株外，其余菌株對甲霜靈的抗性水平均超過100倍，表明多數菌株對甲霜靈已經產生很強的抗藥性。

黃瓜霜霉菌；抗藥性；甲霜靈

由藻界卵菌綱古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk. & M.A. Curtis) Rostovzev]侵染引起的霜霉病是黃瓜生產上最常見、最主要、造成損失最嚴重的病害，廣泛分布于世界各地，在適宜的環境條件下，傳播流行速度快，涉及范圍廣，是黃瓜生產中的一種毀滅性病害[1]，俗稱“跑馬干”、“黑毛”、“瘟病”。據載這種病害先后在全世界約70多個國家有發生，極大的威脅著黃瓜的生產[2]。目前對于該病害的防治主要根據其發生發展規律，通過抗病品種的使用、生態防治以及化學防治等措施的協調運用進行綜合防治。甲霜靈是目前生產上常用的殺菌劑，由于使用頻率高，劑量大，且連年使用，導致病菌抗藥性逐步增強，致使防治效果下降。

甲霜靈(metalaxyl)是一種苯基酰胺類內吸性殺菌劑，又被稱為瑞毒霉、甲霜安、雷多米爾等，具有良好的保護和治療作用[3]，是卵菌病害防治的常用藥劑之一。

苯基酰胺類殺菌劑包括酰基丙胺酸類(甲霜靈、呋霜靈、苯霜靈)、丁酸內酯類(甲呋酰胺)和惡霉靈。其作用機制主要是抑制病原菌rRNA聚合酶，進而抑制rRNA的合成。此類殺菌劑為特異性位點抑制劑，特征是對病原菌某一個作用位點起作用，即只對病原菌的單一代謝環節起作用，如果此位點發生突變，藥劑將不能與其產生作用，因此容易導致病原菌對藥劑產生抗藥性。同時，該類藥劑之間存在交互抗藥性，而且抗性水平普遍較高，并能穩定遺傳[4]。黃瓜霜霉菌對苯基酰胺類殺菌劑的抗藥性，是植物病原菌抗藥性突出的問題之一[5-8]。1980年以色列首次報道甲霜靈對黃瓜霜霉病的防治失敗[9]，之后歐洲等地發現霜霉菌對甲霜靈產生嚴重的抗藥性.。Urban等2001-2004年在捷克9個地方采集了98株黃瓜霜霉菌，測定其對甲霜靈的抗藥性，結果發現，菌株對甲霜靈已產生明顯的抗藥性。我國使用甲霜靈進行黃瓜霜霉病防治相較于歐洲國家稍晚，1979-1986年，甲霜靈才被廣泛應用于防治黃瓜霜霉病。1990年，黃瓜霜霉菌對甲霜靈的抗藥性已是高抗水平，在北京、保定等地普遍存在高抗菌株。王文橋等通過對黃瓜霜霉菌標樣進行抗藥性監測發現黃瓜霜霉菌對甲霜靈已普遍產生不同程度的抗藥性，而且發現甲霜靈與惡唑烷酮之間存在正交互抗性關系[10]。本文研究了來自我國8個省13個黃瓜主產區霜霉菌對甲霜靈的抗藥性，為科學防治黃瓜霜霉病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試黃瓜品種 感病黃瓜品系L18，由東北農業大學黃瓜課題組提供。在溫室內種植，正常管理。

1.1.2 病原菌 2012-2013年，在黃瓜霜霉病發病盛期，從黑龍江省、吉林省、遼寧省、北京、山東省、江蘇省、湖北省和廣東省8個省份13個黃瓜主產區的大田或溫室中采集黃瓜霜霉病葉(表1)，低溫保存帶回實驗室。

續表1 Continued table 1

編號Code菌株Isolate采集時間Acquisitiontime來源Origin27Pc?sd62013山東省壽光市留呂鎮留呂村28Pc?sd72013山東省壽光市留呂鎮留呂村29Pc?js12012江蘇省連云港市東海縣李埝鄉林場30Pc?js22012江蘇省連云港市東海縣李埝鄉林場31Pc?js32012江蘇省連云港市東海縣李埝鄉林場32Pc?hb12012湖北省武漢市武昌區獅子山華中農業大學農場33Pc?hb22012湖北省武漢市武昌區獅子山華中農業大學農場34Pc?hb32012湖北省武漢市武昌區獅子山華中農業大學農場35Pc?gd12012廣東省廣州市五山區華南農業大學周邊36Pc?gd22012廣東省廣州市五山區華南農業大學周邊

1.1.3供試藥劑 97 %甲霜靈(metalaxyl)原藥，由先正達(中國)投資有限公司提供。將上述原藥用丙酮溶解配制成1×104μg/mL的母液，放置于4 ℃冰箱中保存備用。對離體葉盤進行藥劑處理時，將母液用無菌水稀釋成0、0.01、0.1、1、5、10、50、100和500 μg/mL的系列濃度梯度的藥液，并加入0.005 %的吐溫20。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株對甲霜靈的敏感性測定 采用離體葉盤漂浮法測定36株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感性[11]。采集健康黃瓜植株上葉片全展的第3～5片葉，用打孔器制備成直徑為15 mm的葉盤，準備直徑90 mm的培養皿若干，每皿加入10片葉盤，加入15 mL藥液，葉盤背面朝上置于不同系列濃度藥液中浸泡l h，對照加蒸餾水，每濃度重復3次。將配制好的2×103個孢子囊/mL懸浮液點滴1滴10 μl接種于葉盤中心點，置于12 h光暗交替的培養箱中，RH>80 %、培養箱溫度為18 ℃。培養7 d后測量葉盤上的發病面積，計算防治效果。

病情調查：根據病斑面積占葉盤面積的百分率劃分病級：0 級：無病斑；1 級：病斑占整個葉片<5 %；3級：病斑占整個葉片的5 %～25 %；5 級：病斑占整個葉片的26 %～50 %；7 級：病斑占整個葉片的51 %～75 %；9級：病斑占整個葉片>75 %。

通過DPS軟件，進行藥劑濃度與防效之間的線性回歸分析，將防效轉化為機率值(Y)，藥劑濃度(μg/mL)轉化為負對數(X)，求出毒力回歸方程Y=A+BX，相關系數R2，并根據方程計算4種藥劑對不同菌株的有效抑制中濃度EC50(μg/mL)。

防治效果( %)=

1.2.2 菌株對甲霜靈的抗性水平及抗藥類型 黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感基線采用王文橋等測得的敏感基線：0.0470 μg/mL[7]；根據黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感基線值，由下式求出各菌株對甲霜靈的抗性水平。

參照抗藥類型分級標準[10]，根據抗性水平將不同的黃瓜霜霉菌分為4個類型：敏感型S：抗性水平≤2倍；低抗型LR：2<抗性水平≤10倍；中抗型MR：10<抗性水平≤100倍；高抗型HR：抗性水平>100。

2 結果與分析

2.1 菌株對甲霜靈的敏感性測定

36 株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感性進行測定，結果見表2。對甲霜靈最不敏感菌株的EC50值為171.5480 μg/mL，最敏感菌株的EC50值為1.3277 μg/mL，菌株之間EC50值變化范圍較大，表明供試的不同菌株之間對甲霜靈敏感性差異較大，最大值是最小值的129.20倍，平均EC50值為64.6782 μg/mL。進一步分析發現，來源于不同地區的菌株對甲霜靈的平均 EC50值存在明顯差異，每個省的平均 EC50分布范圍為18.8618～100.4303 μg/mL，遼寧省的平均 EC50值最小為18.8618 μg/mL，江蘇省的平均 EC50值最大為100.4303 μg/mL，最大值是最小值的5.32倍。不同年份采集的菌株對甲霜靈敏感性不同，2012年采集的17個菌株的EC50分布范圍為12.0508～171.5480 μg/mL，平均EC50值為78.9277 μg/mL；2013年采集的19個菌株的EC50分布范圍為1.3277～116.7299 μg/mL，平均EC50值為51.9287 μg/mL。

表2 黃瓜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性

2.2 菌株對甲霜靈的抗性水平

本試驗中黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感基線采用王文橋等測得的敏感基線：0.0470 μg/mL。將采集到的36株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的抗藥性進行檢測，結果見表3。36個菌株中，有3個中抗菌株，占總菌株數的8.3 %；33個高抗菌株，占91.7 %，為優勢群體；無敏感菌株和低抗菌株。各地區采集的黃瓜霜霉菌對甲霜靈抗性水平范圍28.25～3649.96倍，平均抗性水平為1376.13倍；除黑龍江省齊齊哈爾檢測到1株中抗菌株和遼寧省海城檢測到2株中抗菌株外，其余菌株對甲霜靈的抗性水平均超過100倍，表明多數菌株對甲霜靈已經產生很強的抗藥性。2012年采集的17個菌株均為高抗菌株，2013年采集的19個菌株中有16個高抗菌株和3個中抗菌株。

表3 黃瓜霜霉菌對甲霜靈的抗性水平

注：HR和MR分別表示高抗菌株和中抗菌株。

Note：HR and MR respectively represent high resistant and mean resistant isolates.

3 討 論

將36 株黃瓜霜霉菌進行了甲霜靈的敏感性測定，結果顯示，對甲霜靈的EC50值為1.3277～171.5480 μg/mL，菌株之間EC50值變化范圍較大，平均EC50值為64.6782 μg/mL，進一步分析發現，來源于不同地區的菌株對甲霜靈的平均 EC50值存在明顯差異，遼寧省的平均 EC50值最小為18.8618 μg/mL，江蘇省的平均 EC50值最大為100.4303 μg/mL。不同年份采集的菌株對甲霜靈敏感性不同，2012年采集的17個菌株均為高抗菌株，平均EC50值為78.9277 μg/mL；2013年采集的19個菌株中有16個高抗菌株和3個中抗菌株，平均EC50值為51.9287 μg/mL。對甲霜靈的抗藥性檢測結果發現，36個菌株中有3個中抗菌株和33個高抗菌株，無敏感菌株，表明我國黃瓜霜霉菌對甲霜靈普遍產生較高的抗性，因此，應控制甲霜靈的單獨使用，提倡甲霜靈與廣譜性、保護性殺菌劑混用，以增加其防治效果，減少病原菌選擇壓力，防止抗性的快速上升，同時能夠減少環境污染，降低成本。

為了避免長期單一使用一種殺菌劑，應合理進行殺菌劑的輪換和使用，嚴格控制抗藥性風險的殺菌劑在單季的使用次數，進而在一定程度上降低藥劑的選擇壓力，利于減少適合度低的抗藥性菌株群體數量，延緩或克服抗藥性的發生發展。同時還要加強病害短期預測預報，指導農民科學用藥，嚴格按照藥劑生產商的推薦劑量施藥，以達到降低抗藥性產生風險，延長藥劑使用壽命，減少環境污染，降低病害防治成本的目的。

4 結 論

采用葉盤漂浮法測定了來自黑龍江省、吉林省、遼寧省、北京、山東省、江蘇省、湖北省和廣東省8個省份13個黃瓜主產區的36株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感性。黃瓜霜霉菌對甲霜靈的EC50值為1.3277～171.5480 μg/mL，平均EC50值為64.6782 μg/mL。36株菌株中，有3個中抗菌株，占總菌株數的8.3 %；33個高抗菌株，占91.7 %，為優勢群體；無敏感菌株和低抗菌株。

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[11]張艷菊．黑龍江黃瓜霜霉病初侵染源及生理小種分化[D]．東北農業大學博士論文，2006．

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(責任編輯 李山云)

Study on Resistance ofPseudoperonosporacubensisto Metalaxyl

ZHU Hai-juan, LIU Da-wei, ZHANG Yan-ju*, BAI Ling-ling, YANG Jia-le

(College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Helongjiang Harbin 150030,China)

36 strains of cucumber downy mildew in cucumber which were collected from 13 main producing areas in China were investigated to study their resistance to the metalaxyl, the toxicity of metalaxyl toP.cubensiswas determined with leaf disk floating method. The result showed that EC50ofP.cubensisto metalaxyl was 1.3277-171.5480 μg/mL, with the average EC50of 64.6782 μg/mL. There were 3 moderate resistant isolates, accounting for 8.3 % of 36 isolates,33 high resistance isolates, accounting for 91.7 %, were dominant group, and there was non-sensitivity isolate and low resistance isolate. Fungicides sensitivity ofPseudoperonosporacubensisin all areas to metalaxyl was 28.25-3649.96 times, and the mean resistance was 1376.13 times. Except one in Heilongjiang and two isolates in Liaoning were moderately resistant, other isolates were more than 100 times, which indicated that most of the isolates had a very strong resistance to metalaxyl.

Pseudoperonosporacubensis; Fungicide resistance; Metalaxyl

1001-4829(2016)08-1969-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.020

2015-09-21

國家自然科學基金項目(31171792)；黑龍江省自然科學基金(C201428)

祝海娟(1990-)，吉林洮南人，女，碩士研究生，專業方向：植物病理學，E-mail:1255250662@qq.com,*為通訊作者。

S436.3

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