煙草根黑腐病拮抗木霉菌株TB72的鑒定及抑菌作用

易 龍, 肖崇剛

(1. 贛南師范大學生命與環境科學學院，江西 贛州 341000；2. 西南大學植物生態病理研究所，重慶 400716)

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煙草根黑腐病拮抗木霉菌株TB72的鑒定及抑菌作用

易 龍1,2, 肖崇剛2

(1. 贛南師范大學生命與環境科學學院，江西 贛州 341000；2. 西南大學植物生態病理研究所，重慶 400716)

菌株TB72是針對煙草根黑腐病菌從煙草根際土壤中分離篩選出有較強拮抗作用的木霉菌，為進一步明確其抑菌能力、控病效果及其對煙草根黑腐病的生防潛能，本研究通過平板對峙培養法、抑菌活性檢測和控病測試，結合菌株TB72的培養性狀、形態特征和分子鑒定確定其分類地位。試驗結果發現菌株TB72對煙草根黑腐病菌具有明顯拮抗作用，抑菌率達52.3 %；控病試驗表明菌株TB72對煙草根黑腐病的防效達84.5 %，能顯著降低煙株接種病菌后的發病率和病情指數。抑菌活性檢測菌株TB72無菌濾液在測試的各濃度下對病菌菌絲生長和孢子萌發均有較好的抑制效果。通過對菌株TB72的培養性狀、形態特征及ITS序列分析，確定其為木霉屬中的棘孢木霉Trichodermaasperellum。

煙草根黑腐病；木霉菌；生物防治；抑菌作用

由于煙草種植面積的調整，耕作制度及煙草品種的變化，煙草根黑腐病近年有加重為害的趨勢，煙株苗期至成株期均可受害，重者出現萎蔫死亡，造成巨大的經濟損失，已成為威脅煙區煙草生產上重要的土傳病害，其由基生根串珠霉菌(Thielaviopsisbasicola)侵染引起[1]。目前煙草根黑腐病的防治措施主要通過化學藥劑來進行治理[2]，帶來了一系列如農藥殘留等影響卷煙安全衛生等問題，為符合國家煙草專賣局提出的“綠色農業、綠色煙草”的要求，走生態之路、環保之路，尋找其他防控措施以減少農藥殘留和病原菌抗藥性等問題成為當前煙草病害防控研究中的重點任務。木霉菌是植物病害生物防治中重要的生物菌劑，來源于自然，對環境友好，國內外關于其在植物病害防治研究上已取得了良好的效果[3-5]，針對煙草根黑腐病的生防木霉菌相關研究尚未見報道，本文研究了從煙區土壤中分離獲得的對根黑腐病菌有較好拮抗作用的木霉TB72菌株的抑菌和控病作用及其分類學地位，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗菌株: 煙草根黑腐病原菌，分離自煙草根際土壤的木霉菌株TB72，均由西南大學植物生態病理研究所提供。對照藥劑為市售70 %甲基托布津可濕性粉劑(日本曹達株式會社)、50 %多菌靈可濕性粉劑(四川國光農化有限公司)。烤煙品種K326由云南省煙草農業科學研究院惠贈，溫室培育至10片真葉備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌株抑菌作用 采用平板對峙法[6]，將活化的煙草根黑腐病菌直徑5 mm的菌餅接種在PDA平板中心，培養2 d后，將活化的TB72菌株接種在距離靶標菌餅3 cm處，以單獨接種病原菌的平板為對照，26 ℃培養5 d后，分別測量處理病原菌和對照病原菌的生長直徑，觀察記錄抑菌情況，并挑取受抑制的病菌菌絲進行鏡檢。

1.2.2 木霉菌的控病效果 將在PDA平板上活化的直徑為5 mm的TB72菌餅接種到PDB培養液，28 ℃下160 r/min培養7 d，收集發酵液。用5 mL發酵液灌根備用煙苗，每處理15株煙苗，重復4次，設70 %甲基托布津可濕性粉劑、50 %多菌靈可濕性粉劑1000倍液以及清水和液體培養基處理的為對照。上述處理24 h后灌根接種。

將煙草根黑腐病菌接種于PDA平板上，28 ℃培養7 d后，用無菌水將孢子洗脫下來，兩層紗布過濾去除菌絲，配制成2×105個/mL濃度的孢子懸浮液。取2 mL孢子懸浮液灌根接種于煙株莖基部，26 ℃培養15 d后根據國家煙草行業標準[煙草病害分級及調查方法(YC/T 39-1996)]調查發病率及發病嚴重度，SPSS12.0軟件統計分析病情指數和防效。

1.2.3 木霉菌無菌濾液抑菌活性測定 按上述方法將菌株TB72接種到液體培養基中，28 ℃下160 r/min振蕩培養7 d后，用定性濾紙抽濾培養液，盡量除去培養液中的菌絲和孢子，再經10 000 r/min離心20 min，將上清液經孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾除菌即得無菌濾液。

(1)對菌絲生長的抑制作用。采用菌落直徑法，將直徑5 mm的根黑腐病菌菌塊置入含無菌濾液終濃度為3 %、6 %、10 %、15 %的平板，以未接菌的液體培養基過濾液制成的相同濃度的平板為對照，每處理3次重復，26 ℃培養3、6、9 d后，測量各處理菌落增長直徑。

(2) 對孢子萌發的影響。將無菌濾液10 %、20 %、40 %、80 %的稀釋液按1∶1體積比同濃度為2×105個/mL根黑腐病菌孢子懸浮液混和，使無菌濾液終濃度為5 %、10 %、20 %、40 %, 以未接菌的液體培養基過濾液以相同比例處理的作對照，26 ℃下6、12、24 h后鏡檢孢子萌發數，以芽管長度超過孢子直徑一半作為萌發標準，每處理3次重復，計算抑制孢子萌發率。

1.2.4 木霉菌分類鑒定 根據《木霉分類與鑒定》[7]，觀察菌株TB72在PDA培養基上的生長特征、分生孢子梗及分生孢子形態，利用TaKaRa公司的試劑盒提取木霉菌基因組，采用ITS通用引物[8]對木霉菌ITS基因片段進行PCR擴增，PCR擴增產物送交華大基因科技有限公司采用凝膠回收試劑盒回收、純化等，并進行核酸序列測定。將測定的ITS序列在GenBank數據庫中進行BLAST比對，并用MEGA5.03軟件Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 木霉菌株抑菌效果

抑菌實驗表明木霉菌TB72對煙草根黑腐病菌菌落擴展具有明顯拮抗作用，抑菌率達52.3 %，對峙培養中的根黑腐病菌菌落邊緣和抑菌帶接觸部分的菌絲稀疏、長勢減弱，而對照根黑腐病菌生長正常，呈圓形向四周擴展。進一步鏡檢觀察到對峙培養中的根黑腐病菌菌絲及分生孢子梗生長形態均受到影響，表現在菌絲萎縮、呈脫水狀，生長頂端呈泡狀，部分菌絲前端破裂、消解，內含物外溢，失去進一步生長的能力，分生孢子梗形態扭曲、溢縮、呈現暗黑色，不能正常產生分生孢子(圖1)。

2.2 溫室控病試驗

試驗觀察到對照煙苗全部發病，出現萎蔫癥狀，生長受到嚴重影響，而經木霉菌TB72處理的煙苗植株發病率明顯降低，發病程度輕微，未表現出明顯癥狀，生長正常。TB72菌株處理后煙株的病情指數與對照相比，在α= 0.05水平上達到顯著，防治效果達84.5 %(表1)，與對照藥劑多菌靈和甲基托布津處理效果無明顯差異，可作為煙草根黑腐病的生防菌株進一步研究。

2.3 木霉菌無菌濾液對根黑腐病菌的抑制作用

2.3.1 對病菌菌絲生長的抑制作用 從表2可見，無菌濾液在實驗的各濃度下對煙草根黑腐病菌菌絲生長均有抑制作用，6 %以上的終濃度抑菌效果明顯，無菌濾液10 %和15 %濃度處理結果相比，對病菌菌絲生長的抑制作用并無顯著差異，表明10 %是較為理想的處理濃度，隨著無菌濾液濃度的增加，抑制效果并未表現出明顯增效作用。

A:正常菌絲，B:畸形菌絲A: Normal mycelium，B: Deformity mycelium圖1 受木霉菌TB72抑制的煙草根黑腐病菌菌絲形態Fig.1 Morphology of mycelium of T. basicola inhibited by TB72 under the microscope

2.3.2 對病菌孢子萌發的抑制作用 從表3可見，木霉菌TB72菌株無菌濾液在測試的各濃度范圍下對煙草根黑腐病菌孢子的萌發均有抑制作用，在10 %以上的測試濃度下抑制效果明顯，5 %的濃度與其他濃度抑制作用相比，雖然效果不明顯，有大量的病菌孢子萌發，但孢子萌發后產生的芽管生長緩慢、扭曲，不能進一步發育為正常菌絲體。同時還觀察到隨著時間的推移，各處理的抑制率逐漸降低，表明有部分孢子還是萌發出芽管，但萌發后即停止生長，前端膨大、扭曲，失去正常生長的能力。

2.4 菌株TB72的分類地位

菌株TB72在PDA培養基上生長良好，輻射狀向四周同心環擴展，菌絲緊密，暗培養條件下近中央的分生孢子暗綠色，分生孢子壁有細刺，近球形或卵形，分生孢子梗細長、彎曲，次級分枝對生，瓶梗短，中間膨大，基部細。菌株TB72的ITS經PCR擴增測序獲得576 bp的核苷酸序列，將其在GenBank數據庫進行BLAST比對，發現與其同源性較高的菌株均屬于木霉屬，發現測定的TB72菌株ITS序列與數據庫中的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)相應序列相似性達100 %，從構建ITS序列系統發育樹可見菌株TB72與Trichodermaasperellum聚類在同一枝，相似性最高(圖2)。結合菌株TB72的培養性狀，形態特征及ITS序列與T.asperellum一致，確定菌株TB72為棘孢木霉(T.asperellum)。

表1 木霉菌TB72菌株控病效果

注：防治效果=(對照病情指數 -處理病情指數)/對照病情指數。同一列數據標記的字母相同者表示差異不顯著(P<0.05，鄧肯氏新復極差法)，下同。 Note: Control efficacy = (control disease index-treated disease index) /control disease index. Data followed by the same small letters in the same column showed no significant differences at 0.05 level by DMRT. The same as below.

表2 木霉菌TB72無菌濾液對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制作用

表3 木霉菌TB72無菌濾液對煙草根黑腐病菌孢子萌發的抑制作用

注：每個處理檢測150個孢子。

Note： Check 150 conidia for each treatment.

圖2 菌株TB72與相關菌株ITS序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of ITS nucleotide sequences of strain TB72 and its relatives

3 討 論

木霉菌是目前研究最多，應用最廣泛的一種生防菌群，國內外對于木霉菌用于防治植物病害已有成功報道[3,5,9]。本研究菌株TB72經形態學和分子生物學鑒定為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，棘孢木霉是近年記錄發現的木霉菌種，但其具有較好的生防作用，已在國內外得到了公認，是一種具有較好生防潛能的菌種[10-15]，到目前為止，對煙草生產越增危害的根黑腐病的生防研究還落后于其它煙草病害的生防研究，試驗菌株TB72來之于煙區煙株根際土壤，對煙田生態環境更為適應，并且在控病測試中，拮抗木霉菌TB72處理煙草幼苗后，植株發病率和病情指數與對照相比明顯降低，溫室盆栽防效達84.5 %，接近目前在生產上使用的甲基托布津、多菌靈藥劑的處理效果，對煙草根黑腐病有較好的控病作用，顯示該菌株具有較好的開發價值。

本研究測定了木霉菌TB72菌株對煙草根黑腐病菌的抑制能力及其控病作用，發現其對病菌的菌絲生長和孢子萌發有明顯抑制作用，通過阻止病菌菌絲生長和孢子萌發產生的芽管侵入寄主植物而防治病害的發生發展，獲得了有較好的控病效果，因木霉菌還存在對寄主產生誘導抗性、營養競爭、重寄生等復雜的生防機理，TB72菌株代謝產物的提取、濃縮和抗菌物質的深入分析以及其具體的作用機理還有待進一步研究。因此繼續探索其生防機理以明確對病害的控制原理，對于進一步加大其生防效果的大田驗證和生防制劑的研發力度，建立和完善與之配套的施用技術體系，對實現煙草根黑腐病的安全、有效治理具有十分重要的意義。

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(責任編輯 李 潔)

Identification and Inhibition Effect of AntagonisticTrichodermaStrain TB72 againstThielaviopsisbasicola

YI Long1,2, XIAO Chong-gang2

(1. College of Life and Environmental Sciences, Gannan Normal University, Jiangxi Ganzhou 341000, China; 2. Institute of Plant Ecology & Pathology, Southwest University, Chongqing 400716, China)

ATrichodermastrain TB72 which can inhibit the pathogen of tobacco black root rot intensively was isolated and screened from the rhizospheric soil of tobacco fields. In order to evaluate scientifically the biocontrol potential of strain TB72 against tobacco black root rot, by pairing culture on PDA plate, inhibiting the pathogen, disease controlling test and taxonomic identification with cultural character, morphological characteristics and molecular methods, the results showed that theTrichodermastrain TB72 exhibited significantly antifungal activities againstThielaviopsisbasicola, the pathogen of tobacco root rot, and the inhibitory effect reached 52.3 % by pairing culture on PDA plate. It was found that the effect of strain TB72 on reduction the incidence of tobacco black root rot, the control efficacy reaching to 84.5 % in a greenhouse experiment. And the results of inhibiting the pathogen showed that culture filtrate of TB72 was effective for inhibiting mycelium growth and reducing spore germination ofT.basicola. According to the characteristics of cultural, morphological, as well as sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA(ITS), the strain TB72 was identified asTrichodermaasperellum.

Tobacco black root rot;Trichodermaspp.; Biocontrol; Inhibition

1001-4829(2016)08-1889-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.024

2015-06-29

中國煙草總公司科技項目(NY2010060103007)；重慶市煙草公司科技項目(2008YY01010)

易 龍(1978-)，男，博士，教授，主要從事植物病害生物防治研究，E-mail:yilongswu@163.com，Tel：0797-8397768。

S572

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