一株鐵皮石斛組織培養污染內生細菌的分離與鑒定

尹利方，陳澤斌, 2 *，夏體淵, 2 **，耿開友，趙 鳳，靳 松，李靜雯，牛燕芬

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.昆明學院科研處，云南 昆明 650214)

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一株鐵皮石斛組織培養污染內生細菌的分離與鑒定

尹利方1，陳澤斌1, 2 *，夏體淵1, 2 **，耿開友3，趙 鳳3，靳 松1，李靜雯1，牛燕芬1

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.昆明學院科研處，云南 昆明 650214)

對污染鐵皮石斛組培苗的內生細菌進行分離和鑒定，為預防鐵皮石斛組織培養過程中內生細菌污染提供科學依據。采用NA培養基分離純化細菌，通過形態特征、生理生化指標結合16S rDNA序列同源性分析，對引起鐵皮石斛組培苗污染的內生細菌進行鑒定。引起鐵皮石斛組培苗污染的內生細菌為SH42菌株，其形態特征及生理生化指標與莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)基本相同；16S rDNA序列分析結果表明，SH42與B.mojavensis(AM948970)聚在同一系統發育分支，其同源性為99.4 %。因此確定引起鐵皮石斛組培苗污染的內生細菌SH42為莫海威芽孢桿菌。

鐵皮石斛；組織培養；內生細菌；分離；鑒定

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)，為蘭科多年生附生草本植物。生于海拔1600 m的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環境，不耐寒。石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數10種，鐵皮石斛為石斛之極品，鐵皮石斛因表皮呈鐵綠色而得名[1]。鐵皮石斛具有獨特的藥用價值，以其莖入藥，中藥名：石斛，屬補益藥中的補陰藥，《中國藥典》：益胃生津，滋陰清熱[2]。多年以來，商品石斛主要依靠野生藥用石斛資源，隨著藥用石斛開發利用的不斷深入和國內外需求量的逐年增加，中國野生藥用石斛資源遭到了嚴重破壞，有些地區甚至面臨枯竭[3]。

鐵皮石斛的種子極為細小，胚胎發育不完全，缺乏胚乳組織，萌發率極低(不足5 %)，且自然條件下必須與蘭菌共生才能萌發。因此無法在大田或苗床上播種，很難生產足夠的實生苗用于栽培。鐵皮石斛對生長環境要求苛刻，成苗更困難。傳統的人工繁殖方式如分株、扦插等，繁殖速度慢，增殖率很低。因此對其進行人工種苗組織培養快速繁殖技術研究是十分必要的[4]。但在植物組織培養過程中，普遍存在兩種類型的污染：一類是通常所說的污染，即外植體消毒不徹底，無菌操作和培養過程中，如：培養基、接種工具、接種室消毒不嚴格或操作不規范而導致的污染；另一類是內生菌污染，內生菌包括真菌和細菌，本研究探討的是內生細菌所致的污染[5-6]。在鐵皮石斛組培快繁過程中，雖然對初代培養的外植體進行了嚴格的消毒滅菌，但10 d后發現嚴重的細菌污染，污染率高達10 %以上，一旦被污染，菌苔很快布滿培養基表層及外植體的基部，大量消耗營養；外植體停止生長，逐漸枯萎死亡，嚴重影響組培苗的正常生長和繼代。

關于內生細菌在植物組織培養中引起污染的報道，如金線蓮(Anoectochilusroxburghii)組培中污染率達到50 %[7]，仙客來(Cyclamenpersicum)的塊莖組織內生細菌污染率達83.0 %[8]，地黃(Rehmanniaglutinosa)由于有內生細菌的存在污染率達100 %等[9]。從已有的報道看，被鑒定的種類主要有黃單胞菌屬(Xanthomonas)[10]、芽孢桿菌屬(Bacillus)、萄球菌屬(Staphylococcus)[11]、假單胞屬(Pseudomonas)[12]、土壤桿菌屬(Agrobacterium)[13]、葡腸桿菌屬(Enterobacter)、棒桿狀菌屬(Corynebacterium) 、沙雷氏菌屬(Serratia)、短小桿菌屬(Curtobacterium)[14]、歐文氏菌屬(Erwinia)[15-18]等。在組培苗內生菌污染防治的相關報道中，多采用對外植體進行預處理，比如：黃化處理、熱擊、多次消毒、灼燒、酸化培養基、在培養基中加入抗生素，特別是抗生素的使用具有較好的效果[12]。本研究通過NA培養基分離純化內生細菌，再通過形態特征、生理生化指標結合16S rDNA序列同源性分析，對1株引起鐵皮石斛組織培養污染的內生細菌進行了鑒定，為后期鐵皮石斛組織培養污染的預防、無性繁殖技術體系的順利建立提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

污染的鐵皮石斛組培苗由昆明學院農學院植物組織培養實驗中心提供。

1.2 培養基

內生細菌分離和培養用NA培養基，液體培養用LB培養基，細菌DNA提取，16S rDNA片段擴增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程(大連)產品，其余試劑均為國產分析純。

1.3 細菌的分離純化及保藏

挑取污染菌苔接種于NA培養基上進行劃線純化，挑取單菌落于試管斜面中4 ℃保存。

1.4 形態特征觀察及生理生化指標的測定

參照文獻[19]進行芽孢染色后在光學顯微鏡下觀察并拍照。形態特征觀察及生理生化試驗參見《常見細菌系統鑒定手冊》[20]，主要測定項目包括培養性狀、菌體大小、甘露醇產酸、過氧化氫酶試、明膠液、酪蛋白水、苯丙氨酸脫氨、V-P反應、厭氧生長、還原硝酸鹽、水解淀粉、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、葡萄糖產氣、利用葡萄糖、利用蔗糖、利用麥芽糖、利用D-山梨醇、利用乳糖、利用異戊醇、利用蛋白胨、利用牛肉浸膏、利用酵母浸膏、利用KNO3、利用氯化銨。

1.5 16S rDNA序列分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取細菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。PCR反應體系(50 μl)組成：10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[20](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (約50 g/L) 1 μl，Taq酶2.5 U，雙蒸水35.5 μl。PCR擴增按Sambrook方法進行[21]。擴增產物經TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定。將測得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)進行同源性搜索[22]，通過MEGA4.0進行比對，隨后選用Maximum Composite Likelihood距離模型進行UPGMA分析生成系統發育樹，發育樹用Bootstrap法(1000次重復)檢驗。用Megalign軟件，將這些序列用Clustal W法進行多序列比對，建立系統發育進化距離圖。

2 結果與分析

2.1 形態特征觀察

菌株SH42(圖1b)在NA培養基上呈乳白色不透明菌落，菌落卵狀，邊緣稍凸起，中間凹陷，表面干燥有褶皺，邊緣不整齊；芽孢直桿狀(圖2)，約2 μm。依據常見細菌鑒定手冊，生理生化指標均與莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)特征相同(表1)。

a：被SH42污染的鐵皮石斛組培苗；b：SH42在NA培養基上的菌落形態a：Dendrobium candidum’s cultivation seedling polluted by the strain SH42; b：Colony morphologies of SH42 on NA culture medium圖1 菌株SH42的形態特征Fig.1 Morphology of strain SH42

圖2 SH42的芽孢染色(放大1000×)Fig.2 Spore morphologies of strain SH42 under light microscopy (magnification, 1000×)

生理生化指標IndexesofphysiologyandbiochemistrySH42甘露醇產酸+過氧化氫酶試驗+明膠液化+酪蛋白水解-苯丙氨酸脫氨-V?P反應+厭氧生長-還原硝酸鹽+水解淀粉+D?葡萄糖+L?阿拉伯糖+D?木糖+D?甘露醇+葡萄糖產氣-利用葡萄糖+利用蔗糖+利用麥芽糖+利用D?山梨醇+利用乳糖-利用異戊醇-利用蛋白胨+利用牛肉浸膏+利用酵母浸膏+利用KNO3-利用氯化銨-

2.2 16S rDNA序列分析

通過BankIt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)將本研究所得序列SH42提交到Genbank數據庫中，登錄號為KP900948。將菌株SH42的16S rDNA與從GenBank中獲取與該菌株序列同源性較高的部分菌株16S rDNA序列構建系統發育樹(表2、圖3)，該菌株與B.mojavensis(AM948970)聚在同一系統發育分支(圖3)。通過Megalign進行同源性比對發現，SH42與B.licheniformis(EF644414)同源性最高，達99.8 %，而與B.mojavensis(AM948970)同源性為99.4 %(圖4)；系統發育樹與系統發育進化距離表得出的結果不一致，但結合生理生化指標分析，將SH42鑒定為B.mojavensis。

3 討 論

Leifert[23]等研究表明，在初代培養中，表面細菌引起的污染通常在2～3 d就能在外植體周圍的培養基表面形成明顯的水污狀、油污狀、氣泡或干縮的紅、黃、乳白等顏色的菌落；而在外植體培養后3～5 d后才出現的細菌菌落，則可能是由內生細菌引起的污染。本研究在對鐵皮石斛組培苗污染情況調查時，發現在外植體培養后3～5 d沒有細菌污染，而是在10 d后才出現的污染，所以推測可能是內生細菌引起的污染。

表2 用于構建系統發育樹的菌株相關信息

括號中的序號為Genbank登錄號；分支上的數字為自展值百分比；線段0.005為核酸替換率Genbank accession numbers were shown in the parentheses. The number at each branch point was the percentage supported by bootstrap. Bar: 0.0005 subsitutions per nucleotide position圖3 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖4 系統發育進化距離Fig.4 Sequence distance of SH42 based on 16S rDNA full-length sequence

在組培內生菌污染防治的研究中，在培養基中加入抗生素的方法已有報道。Reed等[24]在天竺葵(Pelargoniumhortorum)組培中發現頭孢噻肟(Cefotaxime Sodium)的抑菌效果良好，且對芽的增殖有促進作用。韓美麗[25]等在綠巨人(Spathiphyllumkochii)組培中研究了青霉素鈉、先鋒霉素和慶大霉素對繼代培養中細菌污染的抑制效果，結果表明先鋒霉素的抑菌效果最好，青霉素鈉和慶大霉素次之。本研究中16S rDNA序列分析和生理生化鑒定表明引起鐵皮石斛組培苗污染的細菌是莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)，屬于革蘭氏陽性菌，由于革蘭氏陽性菌細胞壁的特殊成分，使大多數革蘭氏陽性菌對青霉素敏感，因此，可以篩選出一部分既能抑制細菌生長但對植物的生長不產生影響的抗生素應用于鐵皮石斛的組織培養。

從系統發育樹(圖3)來看，SH42與B.mojavensis(AM948970)聚在同一系統發育分支，但從同源性比對來看，SH42與B.licheniformis(EF644414)同源性最高，達99.8 %，而與B.mojavensis(AM948970)同源性為99.4 %，結合生理生化指標結果，最終將SH42鑒定為B.mojavensis。由此可見，基于16S rDNA序列分析的系統發育學研究有一定的局限性，16S rDNA序列同源性更適用于屬以上分類單元，對于屬以下分類單元分辨率明顯低。在某些近緣種的鑒定中，如芽孢桿菌屬中解淀粉芽孢桿菌近緣種，很難精確確定它們的分類地位。因此只有有效地將細菌經典分類學和現代分子分類學進行結合，將表型鑒定和分子生物學鑒定綜合分析才能得出更為可靠的結論。

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(責任編輯 王家銀)

Isolation and Identification of Pollution Endophytic Bacteria during Tissue Culture ofDendrobiumcandidum

YIN Li-fang1, CHEN Ze-bin1, 2 *, XIA Ti-yuan1, 2 **, GENG Kai-you3, ZHAO Feng3, JIN Song1, LI Jing-wen1, NIU Yan-fen1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China;2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China;3.Scientific Research Department, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China)

The advantaged endogenous bacteria, which caused contamination ofDendrobiumcandidumplantlets, was isolated and identified so as to provide scientific references for pollution prevention during its tissue culture. Using the NA culture medium to isolate the strain, the bacterial species were identified by morphology, biochemical and the sequence analysis of the 16S rDNA. The results from physiological and biochemical tests showed that the morphological characteristics of the strain SH42 matched the descriptions ofBacillusmojavensis. The sequence analysis of 16S rDNA indicated that this strain had the same embranchment with theB.mojavensis(AM948970) in the phylogenetic tree with the homology of 99.4 %. The SH42 strain was identified asB.mojavensis.

Dendrobiumcandidum; Tissue culture; Endophytic bacteria; Isolation; Identification

1001-4829(2016)08-1982-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.042

2015-03-26

云南省都市特色農業工程技術研究中心項目(TSNY0201)；國家自然科學基金項目(31460491)；云南省科技廳基礎研究項目(2013FD040)；云南省教育廳科學研究項目(2014Y390)；昆明學院大學生科研項目(XJD16081)；昆明學院“人才引進項目”(YJL14005)；云南省高校優勢特色重點學科(生態學)建設項目(05000511311)

尹利方(1981-)，女，云南昆明人，碩士，講師，主要從事都市農業的教學科研工作，E-mail: 563454379@qq.com，*為共同第一作者，**為通訊作者，E-mail: xiatiyuan@sohu.com。

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