魏 藍,朱月芳,史廣宇,何 理,陳 昱,施維林*(.蘇州科技大學環境科學與工程學院,江蘇 蘇州5009;.蘇州市環境監測中心,江蘇 蘇州 5004;.華北電力大學可再生能源學院,北京 006)
壬基酚對一株銅綠假單胞菌吸附鎘的影響
魏 藍1,朱月芳2,史廣宇1,何 理3,陳 昱1,施維林1*(1.蘇州科技大學環境科學與工程學院,江蘇 蘇州215009;2.蘇州市環境監測中心,江蘇 蘇州 215004;3.華北電力大學可再生能源學院,北京 102206)
考察壬基酚(NP)對一株從重金屬污染場地篩選出的銅綠假單胞菌X吸附鎘(Cd)的影響,在NP濃度分別為0、1.0、10.0mg/L條件下,通過優化吸附條件,研究X菌的Cd2+吸附效果.結果表明,NP與Cd2+共存時,在Cd2+初始濃度為1.0mg/L的溶液中,菌體的最佳投菌量和pH值為1.0g/L和7.0,吸附2h,吸附率可達90.0 %左右.失活菌與活菌的吸附結果表明失活菌的吸附能力較活菌強.NP濃度對吸附的影響結果表明,低濃度NP對菌株吸附Cd2+的抑制作用較小,高濃度NP時抑制作用較大.通過分析X菌處理單一Cd2+及Cd2+-NP復合污染后的紅外光譜圖可知,菌體表面的羥基O—H鍵、酰胺C—N鍵和N—H鍵和氨基均參與吸附反應,并且高濃度NP對菌體表面基團活性影響較大,從而影響其對Cd2+的吸附.
壬基酚;鎘;銅綠假單胞菌X;吸附;表面基團
鎘(Cd)作為工農業使用的原料被廣泛用于電鍍、合金、殺蟲劑和電池制造等行業,其以“三廢”形式進入環境,從而導致 Cd污染嚴重超標,現行管理對其治理要求較為嚴格.傳統的物理和化學方法盡管能夠有效去除土壤中的Cd,但投資較大,且易形成二次污染等問題[1-6].相比于傳統的重金屬污染治理方法,生物吸附技術因其具有高效價廉、無二次污染、操作簡單、可用性強等特點,已成為國內外研究的熱點[7-10].其中,微生物作為首選吸附材料,治理效果較好[11],并且研究
表明,微生物菌體在 Cd處理方面具有良好的活性和吸附效果[12-15].
然而,重金屬污染往往是和其他污染物共存,形成復合污染.壬基酚(NP)作為一種工業使用表面活性劑的降解產物,傳統和深度的廢水處理方法無法將其去除,最終在環境各圈層循環[16-18].生物法處理有機物-重金屬復合污染是個難點,有關NP-Cd復合污染的研究幾乎沒有.文章通過對物化因素的控制,旨在找到 NP存在下微生物對Cd2+的最佳吸附條件,并探究在不同濃度 NP下菌體對Cd2+的吸附效果.
1.1 實驗材料
實驗菌株:篩選自蘇州地區典型污染土壤,經16S rRNA序列比對,鑒定為銅綠假單胞菌,菌株編號為 X,預實驗結果表明在吸附 2h,菌濃度為1.0g/L,pH為7.0且初始Cd2+濃度小于1.0mg/L時,吸附率在80 % ~ 90 %之間,表明其對Cd2+有較好的吸附效果.
營養培養基:牛肉膏 5.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl 5.0g、去離子水1000mL、pH=7.0±0.3.
試劑:Cd標準儲備液 1000mg/L,由分析純CdCl2溶于去離子水得到;NP儲備液 1000mg/L,由優級純 NP(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于無水乙醇得到.
1.2 實驗方法
1.2.1 菌懸液的制備 將已知菌接種于滅菌培養基中,于 30℃,150r/min恒溫搖床中振蕩培養24h后作為母液,4℃冷藏保存.用無菌操作技術將母液以 1%的接種量接種于滅菌培養基內,在上述條件下培養16h至對數生長期,5000r/min離心10min,去上清后,用去離子水清洗3次,稱重后制成菌懸液,備用.
1.2.2 吸附條件優化實驗 (1)吸附時間與 NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
分別添加對數生長期菌懸液于 NP濃度為0,1.0,10.0mg/L,pH為7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌濃度為1.0g/L,溶液總體積為20mL,以不加菌作空白對照.振蕩培養 0.5,1,2,4,8,12,24h時分別取樣,5000r/min離心 10min,取上清過0.45μm水系濾膜,采用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)測定Cd2+濃度.
(2) Cd2+初始濃度與 NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
分別添加對數生長期菌懸液于 NP濃度為0,1.0,10.0mg/L,pH值為7.0的0.1,0.5,1.0,5.0,10.0, 50.0mg/L的Cd溶液中,控制菌濃度為1.0g/L,溶液總體積為 20mL,以不加菌作空白對照.振蕩培養2h取樣,其余操作同上.
(3) 投菌量與NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
分別添加對數生長期菌懸液于 NP濃度為0,1.0,10.0mg/L,pH值為7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌濃度分別為 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5g/L,溶液總體積均為 20mL,以不加菌作空白對照.振蕩培養2h取樣,其余操作同上.
(4) pH與NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
分別添加對數生長期菌懸液于 NP濃度為0,1.0,10.0mg/L,pH值為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌濃度為1.0g/L,溶液總體積為 20mL,以不加菌作空白對照.振蕩培養2h取樣,其余操作同上.
1.2.3 活菌與失活菌吸附 Cd2+的差異 將擴大培養至對數生長期的菌體用2.5%的戊二醛固定,冷藏避光保存 24h,使菌體失活,離心后制成菌懸液,同時制備對數生長期活菌懸液.分別添加菌懸液于NP濃度為0,1.0,10.0mg/L,pH值為7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌濃度為1.0g/L,溶液總體積為 20mL,以不加菌作空白對照.振蕩培養2h取樣,其余操作同上.
1.2.4 不同 NP濃度對菌體吸附 Cd2+的影響將對數生長期菌懸液分別投加到 NP濃度為 0, 0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,50.0mg/L,pH 值為 7.0 的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌濃度為1.0g/L,溶液總體積為 20mL,以不加菌作空白對照.振蕩培養2h取樣,其余操作同上.
1.2.5 紅外光譜分析 分別添加對數生長期菌懸液于NP濃度為0,1.0,10.0mg/L,pH值為7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌濃度為1.0g/L,溶液總體積為 20mL,以不加 Cd2+的純菌懸液作空白
對照.振蕩培養2h取樣,5000r/min離心10min,棄上清.將菌體移入2mL離心管中,10000r/min離心10min,棄上清后置于冷凍干燥機內冷凍 12h.取出后進行KBr壓片,采用傅立葉紅外光譜儀進行分析.
1.3 數據處理

式中:R為菌株對Cd2+的吸附率,%;C0為測得溶液中的初始 Cd2+濃度,mg/L;Ce為測得的反應后溶液中的Cd2+濃度,mg/L;Q為單位質量菌株對Cd2+的吸附量,mg/g;V為溶液體積,L; m為菌株質量,g.
2.1 吸附時間與NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
吸附時間是微生物吸附重金屬的重要參數之一.圖1所示為吸附時間與NP濃度對Cd2+吸附的影響.由圖1可知,無NP時,0.5h內X菌吸附了體系中大部分 Cd2+,吸附率約為 80.2%,隨時間的推移,吸附率波動較小,在8h時基本趨于穩定.當體系中加入NP后,菌體對Cd2+的吸附率低于空白值,且吸附率下降速度先快后慢.不同NP濃度相比,NP對菌體的Cd2+吸附率在2h前無明顯抑制差異,在 2h時開始出現抑制差異并逐漸增大,故將其作為后續實驗中的最適吸附時間.
生物吸附重金屬普遍存在兩個時期,一是快速吸附時期,一般在幾十分鐘內即可吸附 70.0%左右的重金屬,此時主要進行菌體的表面吸附,因此速率快;二是緩慢時期,耗時約為快速吸附的幾十倍甚至更多,因為細胞膜具有磷脂雙分子層,而金屬離子需依靠載體才能實現跨膜運輸進入胞內,在胞內富集,該過程耗能且受細胞代謝和擴散過程影響,所以吸附速率慢[19].在NP和Cd復合污染體系中,兩種污染物一方面通過影響細胞膜的通透性,使其對菌體的毒性增強;另一方面通過影響微生物活性及生長來影響吸附效果[20].

圖1 吸附時間與NP濃度對X菌吸附Cd2+的影響Fig.1 Effect of contact time and NP concentration on the biosorption of Cd2+by bacteria X
2.2 Cd2+初始濃度與 NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
圖2所示為Cd2+初始濃度和NP濃度影響微生物吸附的結果.吸附時間為 2h,隨 Cd2+濃度的增加,對照組單位質量菌體的吸附量由緩慢上升至快速上升,吸附率從無明顯變化至快速下降,在1.0mg/L時達到最大,基本清除了體系中的 Cd2+,此時吸附效果最佳.加入NP后,不同NP濃度對菌體吸附 Cd2+的能力影響甚微.與對照組相比,在Cd2+濃度為 0.1~1.0mg/L時,吸附率有明顯降低趨勢,且差值隨Cd2+濃度的升高而減小,吸附量相對于對照組變化不明顯.當 Cd2+濃度為 5.0~50.0mg/L時,吸附效率均比未添加NP體系明顯提高.
綜上所述,高濃度 Cd2+會抑制生物對其的吸附作用,NP和 Cd2+的聯合抑制作用在Cd2+濃度低時最顯著.單獨 Cd2+作用時,在高 Cd2+濃度下,由于 Cd總量較大,故總體吸附率降低;單位質量菌體的吸附量逐漸升高,是由于菌體顆粒與流體相之間的傳質驅動力的提高,以及吸附質和吸附劑的碰撞次數的增多[21].與對照組相比,加入 NP后,對低濃度Cd2+的吸附抑制可能是因為NP與Cd2+競爭菌體表面的吸附位點以及NP的毒性抑制.而添加NP體系中,高濃度Cd2+吸附率均大于
對照組,可能是由于菌體代謝NP后,菌體的表面變褶皺,更粗糙,比表面積增大,吸附點位增多,從而提高了吸附效果[22].

圖2 Cd2+初始濃度與NP濃度對X菌的Cd2+吸附率(柱狀圖)及單位質量X菌的Cd2+吸附量(折線圖)的影響Fig.2 Effect of initial Cd2+concentration and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X (histogram) and on Cd2+uptake capacity by unit mass of bacteria X (line chart)
2.3 投菌量與NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
投菌量也是影響生物吸附重金屬的重要指標之一.圖 3表明,不加 NP,初始 Cd2+濃度為1.0mg/L,吸附2h時,隨投菌量的增加,菌株對Cd2+的吸附率在1.0g/L時趨于穩定,約為94.2 %,單位質量菌體的吸附量隨投菌量的增加而逐漸降低.當加入 NP后,吸附率隨投菌量的增多呈緩慢增加的趨勢,NP的不同濃度對菌體的 Cd2+吸附效果影響不大.相比對照組,NP-Cd共存體系的菌體吸附能力降低.
因此,無NP體系中,吸附率穩定時,單位質量菌株的吸附量隨菌濃度的增加而降低,很可能是菌量增加,Cd2+的吸附點位充足,Cd2+濃度與菌體濃度的比值變小,從而減少了單位質量菌株對Cd2+的吸附量.NP的加入,會使一部分菌體表面的吸附點位被占據[23],或者抑制一部分菌體的正常生理代謝甚至使其死亡,而死亡的菌株也能吸附Cd2+,同時也可能存在菌體表面變褶皺,吸附點位增多的情況.但由于投加的菌量多,活菌數量遠大于死亡菌株的數量,且死亡菌株中也有部分菌的細胞結構被破壞,不能進行正常的表面吸附,同時,菌量增多會促使Cd2+的釋放能力增強,故綜合考慮吸附率和吸附量相比于對照組均是下降的.

圖3 投菌量與NP濃度對X菌的Cd2+吸附率(柱狀圖)及單位質量X菌的Cd2+吸附量(折線圖)的影響Fig.3 Effect of bacterial concentration and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X (histogram) and on Cd2+uptake capacity by unit mass of bacteria X (line chart)
2.4 pH與NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
pH對重金屬離子的化學性質、離子間的相互作用及細胞表面基團活性都存在明顯影響.圖4所示為pH與NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響.結果表明,若體系中無NP,隨pH的逐漸增大,吸附能力先上升后趨于平穩.加入NP后,不同濃度NP對Cd2+吸附效果影響差異不大.添加NP的體系與對照組相比,在pH為5.0時出現較大差異,pH為7.0~8.0時,NP的抑制差異不明顯,吸附率可達89.9 %,因此將pH=7.0作為后續實驗的最適pH.
pH對細胞表面的官能團變化以及對金屬自身性質的影響,直接或間接導致菌體細胞吸附金屬離子的能力的不同[24].綜上,X菌在中性左右條件下有良好的Cd2+吸附效果.pH低于5時,無NP體系中Cd2+的吸附效果變化較大,可能是pH過低,水合氫離子會與Cd2+競爭吸附位點,因此質子化程度越大,菌體越難吸附Cd2+;同時,pH也可影響微生物的生長代謝,易導致膜電位的改變,使微
生物難以適應新環境而影響吸附 Cd的效果[20]. pH在5.0~7.0時,在同一pH條件下,與對照組相比,NP的存在均使 Cd2+的吸附率大大降低,可能是因為NP與Cd2+存在吸附點位的競爭,NP的吸收占據優勢,導致菌體難以吸附 Cd2+.而 pH>7.0后,無論NP存在與否,不同pH間的Cd2+吸附效果均無明顯差異,說明菌體表面的吸附位點已達到飽和,NP對Cd2+的吸附影響不大.

圖4 pH和NP濃度對X菌的Cd2+吸附率的影響Fig.4 Effect of pH and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X
2.5 活菌與失活菌吸附Cd2+的差異
為保障菌體內部結構穩定,最大化地保留其表面的有效官能團,阻止其生長代謝,研究活菌與失活菌對 Cd2+的吸附差異,本文實驗采用戊二醛對菌體進行固定,結果如圖5.由圖5可知,無論NP存在與否,失活菌體的吸附效果明顯優于活菌,這一結果與白潔瓊等[25]的研究結果一致,說明X菌的吸附機理與菌體活性有關.無 NP體系中,1.0g/L失活菌對Cd2+的吸附效果優于相同量的活菌吸附效果.比較不同NP濃度,菌體的Cd2+吸附效果均無明顯差異;但與對照組相比,活菌的吸附能力大幅度下降,而失活菌的吸附能力變化微小.
分析吸附率的變化趨勢得出,活菌對 Cd2+的吸附可能是表面吸附/脫附與主動運輸/釋放相結合,進而將積累在表面和胞內的超負荷 Cd2+排出細胞,同時,菌體自身釋放的陽離子與Cd2+形成競爭關系會抑制其對 Cd2+的吸附.固定后的菌體已經失去活性,對Cd2+的吸附以表面吸附為主,不存在對Cd2+的主動運輸/釋放.同時,體系中存在NP時,NP的毒性會影響活菌的正常生長代謝,或是NP與 Cd2+對有效吸附位點的競爭,導致活菌吸附能力下降.而失活菌不能進行生長代謝,故 NP濃度對其無明顯影響[23].

圖5 生理條件與NP濃度對X菌的Cd2+吸附率的影響Fig.5 Effect of physiological conditions and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X
2.6 不同NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響
在最佳吸附時間、Cd2+初始濃度、投菌量及pH的條件下,改變NP濃度,獲得菌體對Cd2+的吸附效果(圖6).由圖6可知,隨著NP濃度的增加,X菌對 Cd2+的吸附效率降低.無 NP,吸附 2h時, 1.0g/L菌體對 1.0mg/L Cd2+的吸附率達 89.8%,表明X菌能很好的吸附Cd2+.當加入NP時,NP濃度的升高使菌株吸附 Cd2+的能力總體呈緩慢下降趨勢.當NP濃度為0.1mg/L時,菌體的吸附率較對照組下降了 25.7%;而 NP濃度在 0.1~10mg/L范圍內,菌體吸附率下降非常緩慢;當濃度升至50mg/L時,吸附率迅速下降到8.6%,菌株基本喪失了吸附能力.
通過以上分析,NP對菌體吸附 Cd2+有一定的影響,低濃度NP影響較小,高濃度NP影響較大.可能原因是低濃度NP能為Cd的去除提供碳源和能源,故有較好的吸附效果[21].隨著NP濃度增高,NP-Cd復合破壞了菌體細胞膜的通透性,影響其生長代謝機制,對菌體的毒害作用逐步增強;
此外,由于菌體對NP的吸收位點與對Cd2+的吸附位點相同,在高濃度NP條件下,NP更易于接觸有效位點,且易于達到吸附飽和,從而與Cd2+形成顯著競爭,這都會導致菌體難以吸附Cd2+.

圖6 NP濃度對X菌的Cd2+吸附率的影響Fig.6 Effect of NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X
2.7 紅外光譜分析
鑒于以上,即在NP存在時,X菌的Cd2+吸附基本為表面吸附,進一步考察吸附前后菌體表面官能團的變化,結果如圖7所示.可以看出,菌體在不同Cd2+和NP濃度下吸附前后的峰數目和峰形變化明顯,部分吸收峰發生偏移現象,說明X菌在處理單一Cd2+及Cd2+-NP復合污染時有表面基團參與,主要在 2800 ~ 3500cm-1和 500 ~1700cm-1范圍內出現吸收帶[25].3000 ~ 3400cm-1處的譜鋒是 O—H 的伸展運動[26],2800 ~3000cm-1為 CH2的不對稱伸縮運動[27],1400 ~1650cm-1處的譜鋒來自典型的酰胺Ⅰ帶(C=O的伸縮振動)、酰胺Ⅱ帶(N—H的彎曲振動和C—N的伸縮振動)和酰胺Ⅲ帶(C—N的伸縮振動),1200 ~ 1400cm-1處的峰形變化與P—O和C—S的疊加振動和胺基化合物中C—N的伸縮振動等有關,低于 650cm-1是金屬離子與氧締合形成的譜峰.
3000 ~ 3400cm-1范圍內隨著單一及復合污染物的加入,峰形變圓鈍,證明菌體表面存在羥基,并且可能參與 Cd2+的吸附[28].同時,2800 ~ 3000cm-1處的峰形變化可能是由于相鄰基團羥基的變化所致,也可發現,高濃度NP存在時峰形變尖銳,說明高濃度NP對官能團影響較大.1400~ 1650cm-1處的譜峰向低波數處微小偏移,說明Cd2+與酰胺發生絡合,降低其活性,且a~d的峰形由圓鈍變尖銳,說明高濃度NP影響酰胺作用.

圖7 X菌處理單一Cd2+及Cd2+-NP復合污染后的紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of bacteria X before and after the treatment of single Cd2+and combined Cd2+-NP
3.1 在NP與Cd2+共存時,通過對物化因子的控制,利用一株銅綠假單胞菌X吸附Cd2+,在吸附時間為2h,投菌量為1.0g/L,pH為7.0時,Cd吸附條件最適宜;初始Cd2+濃度為1.0mg/L時,吸附率可達到90.0 %左右.
3.2 NP存在時,X菌對Cd2+的吸附與菌體活性有關,失活菌的吸附效果更好,但不同NP濃度對吸附基本無影響,這也說明活菌對 Cd2+的吸附不僅與細菌表面吸附/脫附有關,還與主動釋放/主動運輸等過程有關.
3.3 不同NP濃度對菌體吸附Cd2+的影響不同,低濃度NP影響較小,高濃度NP影響較大,且高濃度NP能影響官能團反應,從而影響Cd2+的吸附.
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Biosorption of cadmium in nonylphenol-cadmium compound pollution by Pseudomonas aeruginosa X.
WEI Lan1, ZHU Yue-fang2, SHI Guang-yu1, HE Li3, CHEN Yu1, SHI Wei-lin1*(1.College of Environmental Science and Engineering, University of Science and Technology of Suzhou, Suzhou 215009, China;2. Environmental Monitoring Center of Suzhou, Suzhou 215004, China;3.College of Renewable Energy Technology, North China Electric Power University, Beijing 102206, China). China Environmental Science, 2016,36(11):3495~3501
Effects of nonylphenol (NP) on the adsorption of cadmium by Pseudomonas aeruginosa X, which is screened from cadmium (Cd) contaminated site was investigated. Experiments were undertaken to study the biosorption of cadmium at NP concentrations of 0、1.0、10.0mg/L respectively. It was revealed that the optimal concentration of Pseudomonas aeruginosa X and pH were 1.0g/L and 7.0respectively with initial Cd2+concentration of 1.0mg/L and hybrid with NP. With two hours absorbing, the biosorption rate was about 90 %. The results of biosorption by devitalized bacteria and live bacteria indicated that the adsorption ability of devitalized bacteria was better than that of live bacteria. By considering the different concentrations of NP as variables, it was found that the lower concentration of NP has little suppressing effect on the adsorption of Cd2+. But the suppressing effect was significant at higher concentrations of NP. FTIR spectra of bacteria X treating Cd2+and compound of Cd2+-NP separately indicated that the functional groups of hydroxyl group and amido were involved in the adsorption reaction. Moreover, it indicates that high concentration of NP has a greater impact on the activity of cell surface groups. Thus, high concentration of NP affects the adsorption of Cd2+.
NP;Cd;Pseudomonas aeruginosa X;biosorption;surface groups
X17
A
1000-6923(2016)11-3495-07
魏 藍(1993-),女,吉林長春人,蘇州科技大學碩士研究生,主要從事土壤重金屬污染的修復研究.
2016-03-20
國家自然科學基金項目(31570515);江蘇高校水處理技術與材料協同創新項目;蘇州市科技支撐計劃項目(SS201421, SS201523);蘇州市環保科技項目(2015-3);江蘇省自然科學基金青年基金(BK20150287)
* 責任作者, 教授, weilin-shi@163.com