豬圓環病毒2型烏魯木齊分離株全基因序列遺傳變異分析

蔡擴軍，李愛巧，何生，楊啟元，徐敏，楊小亮，王濤

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊830063；2.烏魯木齊市米東區畜牧獸醫站，烏魯木齊831400）

豬圓環病毒2型烏魯木齊分離株全基因序列遺傳變異分析

蔡擴軍1，李愛巧1，何生2，楊啟元1，徐敏1，楊小亮1，王濤1

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊830063；2.烏魯木齊市米東區畜牧獸醫站，烏魯木齊831400）

為分析烏魯木齊市豬圓環病毒2型（PCV2）遺傳變異情況，對疑似感染PCV2組織樣品的全基因組進行PCR擴增、克隆和測序，并進行序列比對與遺傳進化分析。結果表明，測序的5株PCV2基因組3株全長為1 766 bp，2株全長為1 767 bp，5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之間，與GenBank國內外已發表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%～99.7%之間；遺傳進化樹顯示，3株屬于新出現的PCV2d亞型毒株，2株屬于國內優勢流行的PCV2b亞型毒株。

豬圓環病毒2型；遺傳變異；分析

豬圓環病毒病是由豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起的豬的一種傳染病，可引起一系列相關的臨診病癥，其中包括斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙等，還可能與增生性腸炎、壞死性間質性肺炎、仔豬先天性震顫等有關[1]。其臨床表現多種多樣，主要特征為體質下降、消瘦、貧血、黃疸、生長發育不良、腹瀉、呼吸困難、母豬繁殖障礙、內臟器官及皮膚的廣泛病理變化，特別是腎臟、脾臟及全身淋巴結的高度腫大、出血和壞死。PCV2主要侵害機體的免疫系統，該病可導致豬群產生嚴重的免疫抑制，從而容易繼發或并發其他疾病[2]。自1997年加拿大首次報道以來，該病已遍及世界各養豬國家和地區[3]。我國于1999年首次發現，目前該病已在我國豬群中廣泛流行，給養豬業造成了很大的經濟損失，并引起了高度關注[4-5]。

PCV2為圓環病毒科（Circoviridae）圓環病毒屬成員，病毒粒子為二十面體對稱結構，含有單股負鏈環狀DNA，基因組全長為1 767 bp或1 768 bp，含有11個閱讀框[6-7]。而近年來不斷有PVC2基因組為1 766 bp新毒株的文獻報道[7-8]，該病毒的基因組不斷地發生變異，造成的危害日益嚴重[9]。鑒于此，本文通過對烏魯木齊市PCV2流行毒株的全基因組序列進行測序，并跟國內外代表毒株進行比對分析，對流行毒株的變異規律和分子流行病學特征進行探究和分析，以期為本地區PCV2防治提供必要的分子流行病學信息。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2016年3月15日至4月20日在新疆烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心進行。

1.2 病料樣品

疑似感染PCV2豬的肺臟、淋巴結、扁桃體等組織病料。

1.3 主要試劑

病毒核酸純化試劑盒、Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）購自TaKaRa公司。

1.4 引物設計

上游引物：5'-CCCGTTGGAATGGTACTCCTCAA CTG-3'；下游引物：5'-CGGGGTCTGATTGCTGGTAA TCAGAAT-3'。預計擴增目的片段大小1766~1768bp。

1.5 全基因組的擴增與測序

按照病毒核酸純化試劑盒說明書提取PCV2陽性樣品的DNA。按照Premix Taq說明書對提取的DNA進行PCR擴增，反應體系50 μL：Premix Taq 25 μL；上下游Primer（25 μmol/L）各1 μL；Template DNA 2 μL；RNase Free ddH2O添加至50 μL。反應程序為：94℃30 s、56℃30 s、72℃2 min，32個循環；72℃10 min，取10 μL PCR產物進行凝膠電泳，并選擇符合目的條帶大小、條帶單一且明亮的PCR陽性產物送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.6 基因序列遺傳進化分析

應用生物學分析軟件GenBank Blast和DNAStar對擴增的核苷酸序列與GenBank中登錄的PCV2全基因序列進行同源性比較，利用Mega 5.0軟件，NJ法構建系統進化樹（boot strap值為1 000循環）。

2 結果

2.1 目的基因的擴增結果

用RT-PCR法從9份疑似感染PCV2的樣品中擴增出7份與預期片段大小相符的特異性片段，2份可疑樣品，擴增結果見圖1。

圖1 PCV2全基因PCR擴增電泳結果

2.2 目的基因的序列測定結果

送出測序的5株PCV2樣品3株基因組全長1 766 bp，2株1 767 bp，登錄NCBI利用Blast對測序結果進行分析，結果表明，擴增得到的5條序列為PCV2基因序列，分別命名為WLMQ-1株（1 766 bp）、WLMQ-2株（1 767 bp）、WLMQ-3株（1 767 bp）、WLMQ-4株（1 766 bp）、WLMQ-5株（1 766 bp）。

2.3 PCV2全基因組核苷酸同源性對比分析

5株PCV2全基因組核苷酸序列之間的同源性為96.1%～99.5%；與1010 PCV2a Canada、DBNSX07、DK1980 PCV-2cDenmark、PCV2 LG、PCV2 WuHan、PCV2-09CQ、PCV2-09HeN、PCV2-09HLJ、PCV2-HB、PCV2-QD、PCV2-SC、PCV2-SD、PCV2-SH、PCV2-SHZ、PCV2-SZ、PCV2b France、TJ PCV2d毒株核苷酸序列同源性分別為95.3%～96.2%、96.0%～99.5%、94.7%～95.4%、95.5%～95.8%、95.5%～95.8%、96.2%～99.7%、96.5%～98.8%、95.8%～99.4%、96.2%～99.2%、95.9%～99.5%、94.5%～95.5%、96.3%～98.0%、95.8%～99.4%、95.9%～99.5%、95.1%～95.8%、96.2%～99.7%、96.8%～98.4%。具體比對結果見圖2。

圖2 PCV2分離株全基因組核苷酸同源性比較

2.4 PCV2全基因序列遺傳進化關系

將5株PCV2全基因序列與國內外已登錄的17株PCV2全基因序列構建遺傳進化樹（圖3），結果顯示，WLMQ-1、WLMQ-5分離株與PCV2-09CQ、 PCV2-SHZ、TJ PCV2d同屬于PCV2d亞型；WLMQ-2、WLMQ-3與PCV2b France、DBN-SX07同屬于PCV2b亞型；5株分離株與PCV2a亞型親緣關系較遠，與PCV2c亞型親緣關系最遠。

圖3 PCV2全基因序列遺傳進化關系

3 討論

PCV是迄今發現的一種最小的動物病毒[10]。目前已知的PCV有2個血清型，即PCV1和PCV2[11]。PCV1沒有致病性，PCV2具有致病性。PCV2全基因組存在1 767 bp或1 768 bp兩種不同的長度。本研究測序的5株毒株中3株序列長度為1 766 bp，屬于變異毒株，提示該地區PCV2在分子水平上已經出現了的變異。這也在分子水平上闡明了在烏魯木齊地區PCV2流行毒株的復雜性和多樣性，而導致這一現象的原因可能與近年來新疆大力發展養豬業而從不同地區引進了隱性感染PCV2的種豬有一定關系。

最新的研究結果把PCV2分為了PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e等5種基因型亞群[12-13]，國內外PCV2分子流行病學的分析結果表明，PCV2基因型發生了由PCV2a到PCV2b的轉換，我國PCV2存在的基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2d，以PCV2b流行毒株為主，是造成PCV2流行的主要病因[7，14]。全基因組核苷酸同源性比較發現，5株烏魯木齊PCV2分離株核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之間，與國內外已發表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性也在94.5%～99.7%之間。從本次遺傳進化樹可以看出，烏魯木齊地區的PCV2基因型3株為PCV2d亞型，2株為PCV2b亞型，據此推測烏魯木齊地區PCV2的流行株情況可能與全國流行情況存在一定差異，PCV2d亞型可能逐步成為該地區PCV2流行毒株的優勢基因型，這給本地區PCV2感染的防控帶來了難度，應引起足夠的重視。另外，遺傳進化分析結果顯示，烏魯木齊地區正在使用的疫苗株DBN-SX07屬于PVC2b亞型，只與5株病毒中的2株處在同一分支上，說明目前使用的疫苗可能與流行的毒株不是最佳匹配，其疫苗效果可能不是十分理想，需尋求更加合適的疫苗。

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（編輯：富春妮）

S858.282.65+9.2

A

1002-1957(2016)05-0097-03

2016-08-04

新疆維吾爾自治區科技廳科技援疆項目（201491165）；烏魯木齊市科技局應用開發研究計劃（Y141210013）

蔡擴軍（1985-），男，河南虞城人，獸醫師，碩士，主要從事動物疫病診療工作.E-mail:caikuojun@163.com

李愛巧（1966-），女，農業技術推廣研究員，主要從事動物疫病防控工作.E-mail:laq4616369@126.com