順鉑處理后幾種hTERT mRNA剪接異構體的變化*

楊夢莉， 陳香嶺， 隋 旭， 廉亞茹， 馬春霞， 姚宇峰， 史 荔， 馬千里, 俞建昆**

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 醫學生物學研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明理工大學， 云南 昆明 650093; 3.昆明醫學大學第三附屬醫院 胸外科， 云南 昆明 650118)

?

順鉑處理后幾種hTERTmRNA剪接異構體的變化*

楊夢莉1， 陳香嶺1， 隋 旭2， 廉亞茹1， 馬春霞1， 姚宇峰1， 史 荔1， 馬千里3, 俞建昆1**

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 醫學生物學研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明理工大學， 云南 昆明 650093; 3.昆明醫學大學第三附屬醫院 胸外科， 云南 昆明 650118)

目的： 利用順鉑處理肺癌、宮頸癌細胞和人胚腎細胞，檢測人類端粒酶逆轉錄酶催化亞單位(hTERT)mRNA的選擇性剪接是否發生變化。方法:將培養的肺癌A549和H1299細胞，宮頸癌C33A、SiHa和CaSki細胞及人胚腎293FT細胞分為實驗組和對照組，用順鉑處理實驗組細胞，DMSO處理對照組細胞；設計hTERT α+β+、α+β-、α-β+、INS3及DEL[e2]引物，提取兩組細胞的總RNA，利用RT-PCR檢測hTERTmRNA 剪接異構體表達。結果:與對照組細胞相比，隨著順鉑濃度的增加，肺癌A549和H1299細胞，宮頸癌C33A、SiHa和CaSki細胞以及人胚腎293FT細胞中hTERTα+β- 和INS3異構體比例升高，而DEL[e2]異構體變化不明顯。結論:在順鉑引起的DNA損傷情況下，細胞可利用hTERTmRNA選擇性剪接調控機制進行調節，通過改變不同異構體的量和所占比例，從而調節端粒酶功能活性。

肺腫瘤； 宮頸腫瘤； 人胚腎細胞； 細胞，培養的； 人類端粒酶逆轉錄酶催化亞單位； 順鉑

端粒是真核細胞線性染色體的末端物質，由TTAGGG重復序列構成，端粒DNA序列具有高度保守性，在維持染色體穩定性中起重要作用。人端粒酶主要由兩個亞單位組成，即端粒酶RNA(hTR)和催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)[1]。hTERT作為端粒酶的限速酶，在端粒酶的活性調節中起關鍵作用。研究表明，端粒酶活性的調節主要依賴于hTERTmRNA的表達，而hTERTmRNA表達會由于選擇性剪接(alternative splicing)而產生多個異構體，到目前為止已發現14種hTERT 轉錄異構體，主要是由于外顯子的缺失及內含子的插入造成的[2-3]。Pre-mRNA選擇性剪接作用可以調節hTERT基因的表達量，同時也可以改變蛋白的結構，對端粒酶活性產生重要的影響[4]。近來研究表明，用DNA損傷試劑或者輻射處理細胞后，一些與細胞周期和凋亡相關的基因會相應的發生選擇性剪接的變化[5]。抗癌藥物順鉑具有誘導細胞凋亡作用，可引起DNA鏈斷裂，本研究選取肺癌A549、H1299細胞，宮頸癌C33A、SiHa和CaSki細胞及人胚腎293FT細胞用順鉑處理，探究hTERT的α+β+、α+β-、α-β+、INS3及DEL[e2]幾種剪接異構體是否發生改變，并且這些異構體所占比例在順鉑不同濃度處理樣品中是如何變化的，為探討端粒酶不同剪接異構體的功能及其調控剪接信號通路和機制提供信息，為臨床治療腫瘤提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與分組

細胞NCI-H1299、C33A、SiHa、CaSki及293FT購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)，A549購自中國科學院昆明動物所細胞中心。NCI-H1299細胞使用Hyclone改良型RPMI-1640培養基，其余細胞均使用Hyclone DMEM/HIGH GLUCOSE培養液(GE Healthcare Life Sciences)，兩種培養液均含10%FBS(Certified Foetal Serum, Biological Industries)，青霉素和鏈霉素濃度分別為100 U/mL和100 mg/L,培養條件為37 ℃、5%的CO2。順鉑購自Sigma Aldrich公司，用DMSO溶解后使用。順鉑加入時細胞處于對數增長期，在培養皿表面覆蓋率為70%～90%。5種腫瘤細胞都分為實驗組和對照組，實驗組細胞用不同濃度的順鉑處理，對照組細胞用相應濃度的DMSO處理；對照組中A549、H1299、C33A、SiHa、CaSki、293FT細胞加入DMSO濃度分別為56、72、63、56、42、63 μmol/L。實驗組中A549、H1299順鉑濃度分別是7、14、21、28、35、42、49、56 μmol/L和9、18、27、36、45、54、63、72 μmol/L，C33A濃度為 9、18、27、36、45、54、63 μmol/L,SiHa濃度為8、16、24、32、40、48、56 μmol/L,CaSki濃度為6、18、24、30、36、42 μmol/L，293FT濃度為9、18、27、36、45、54、63 μmol/L。

1.2 提取總RNA

各組細胞在順鉑或DMSO處理24 h時傾倒除去培養液，用預冷的PBS沖洗1次，徹底除去PBS后，加入RNAiso Plus(TakaRa公司)，按照試劑說明書程序提取總RNA。

1.3 檢測異構體

oligo(dT)18引物用PrimeScript Ⅱ逆轉錄酶(TaKaRa公司)進行逆轉錄反應得到cDNA第一鏈，再用PCR引物進行PCR擴增檢測。α+β-和α-β+ 上游引物為5′-GCCTGAGCTGTACTTTGTCAAG -3′,下游引物為5′-GCAAACAGCTTGTTCTCCATGTC-3′。引物設計起始于外顯子5和終止于外顯子9，產物大小為274、456 bp；INS3上游引物為5′-CTCCATCCTGAAAGCCAAGAAC-3′,下游引物為5′-TGTCGAGTCAGCTTGAGCAG-3′,引物設計起始于外顯子14和終止于外顯子15，產物大小為123、282 bp；DEL[e2]上游引物ACTACCGCGAGGTGCTGC，下游引物GACGACGTACACACTCATCAG，引物設計起始于外顯子1和終止于外顯子3，產物大小259、1613 bp，如圖1所示。PCR反應總體積20 μL，94 ℃ 3 min預變性；94 ℃ 變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35次循環，72 ℃延伸5 min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 數據分析

利用RT-PCR進行試驗檢測，實驗所得數據用Bio-RAD凝膠成像儀自帶分析軟件處理，最終數值為3次實驗結果平均值。

注：全長α+β+剪接異構體包含16個外顯子和完整的RT結構域，α-β+剪接異構體位于第6外顯子處缺失36個核

2 結果

2.1hTERTα+β- mRNA異構體的變化

與對照組細胞比較，實驗組A549、H1299、293FT、C33A、SiHa及CaSki細胞隨著順鉑濃度的增加，α+β+異構體(*a)的比例呈先增加、后逐漸降低的趨勢，而α+β-異構體(*b)的比例逐漸增加，其中293FT、CaSki以及C33A細胞中出現36 bp的α-β+(*c)目標帶，變化趨勢與α+β+異構體一致。如圖2。

2.2hTERTINS3 mRNA異構體的變化

與對照細胞相比，在實驗組A549、 H1299、293FT、C33A和SiHa細胞隨著順鉑濃度的增加，α+β+(*b)異構體的比例呈逐漸降低的趨勢，而INS3異構體(*a)的比例逐漸增加。如圖3。

2.3hTERTDEL[e2] mRNA異構體的變化

實驗組A549、SiHa、H1299細胞中，α+β+異構體(*a)和異構體DEL[e2](*b)與對照細胞相比，變化趨勢不明顯。在C33A細胞中，α+β+異構體(*a)變化趨勢不明顯，因DEL[e2]異構體缺失少，導致DEL[e2](*b)未出現目標條帶。

3 討論

hTERT是端粒酶功能的限速酶，端粒酶的活性是由hTERT在轉錄水平調控的，hTERT的轉錄存在著選擇性剪接的現象。已有研究表明，過表達α+β+異構體和α+β-異構體都有保護細胞在順鉑處理情況抗凋亡的作用，因α+β-異構體RT 功能結構域的缺失，導致其沒有端粒酶活性[6]。本文研究結果顯示，α+β-異構體在順鉑處理時，隨著順鉑濃度增加而所占比例逐漸增高，可能原因是在順鉑造成DNA 損傷時，細胞生長分裂受抑制，高表達的α+β-轉錄水平導致端粒酶處于低活性狀態，有利于細胞阻滯于G2期檢查點進行DNA損傷修復。此外，Shusen Zhu等[7]人報道了INS3異構體可抑制端粒酶活性，細胞生長變緩，具有負調控功能。本實驗結果顯示INS3異構體隨著順鉑濃度增加，比例逐漸增加，由此可以推測在順鉑處理作用下，INS3異構體因RT結構域的不完整導致端粒酶活性逐漸降低，但INS3異構體是否也具有抗凋亡作用還需進一步探究。hTERT DEL[e2]在順鉑處理下，無明顯變化，但目前DEL[e2]異構體與端粒酶活性的相關性還未曾報道，是進一步需要研究的問題。幾種剪接異構體的變化說明在應對順鉑引起的DNA損傷中，hTERTmRNA剪接異構體的水平和比例的變化是引起端粒酶功能活性降低的一種調節方式。

注：*a表示α+β+異構體，*b表示α-β+異構體，*c表示α+β-異構體;-A表示α+β+異構體剪接百分比；

注：*a表示α+β+異構體，*b表示α-β+異構體，*c表示α+β-異構體;-A表示α+β+異構體剪接百分比；

注：*a表示α+β+異構體，*b表示α-β+異構體，*c表示α+β-異構體;-A表示α+β+異構體剪接百分比；

近年來研究發現 NF-κB 信號通路的激活與 hTERT 的表達和端粒酶活性有關。利用 NF-κB抑制劑姜黃素抑制神經母細胞瘤細胞的 NF-κB 信號通路，可以明顯的抑制端粒酶活性，hTERTmRNA和蛋白表達[8]。Sykorova等[9]實驗進一步說明 NF-κB 可以通過對hTERT啟動子的增強調節而調節 hTERT 的表達。此外，DEL[e4-13]異構體通過剪接調控能夠在端粒酶陽性和陰性細胞中增強Wnt信號[10],但是在順鉑造成的DNA損傷情況下，α+β-的活性是否與Wnt 信號通路有關，NF-κB 信號通路的激活與 hTERT 的表達和端粒酶活性影響還未有人報道，以上已證實的研究結果將為本試驗進一步研究在順鉑造成細胞DNA損傷情況下，探究引起hTERT剪接變化的信號通路奠定基礎。

目前已報道在DNA損傷情況下，TERT會從核內轉位至線粒體，在線粒體中的TERT 能夠降低線粒體中活性氧ROS(reactive oxygen species)水平，減輕線粒體DNA(mtDNA)損傷，通過增強線粒體功能從而提高細胞應對DNA損傷能力使細胞呈現抗凋亡的效應[11]，且α+β+和α+β-異構體在順鉑處理下都具有抗凋亡的作用[6]，過表達α+β+異構體可提高基因組穩定性和DNA修復[12]。本實驗結果顯示隨著順鉑濃度增加，α+β-異構體比例增加，文獻已報道α+β+和α+β-異構體都能定位于線粒體，推測α+β-與α+β+異構體可能具有幫助或協同DNA修復功能，即在線粒體中通過增加順鉑誘導的DNA損傷修復從而對細胞進行凋亡保護，但這一問題還需進一步證實。而對于INS3和DEL[e2]異構體在順鉑處理下，hTERT是否會從核轉移至線粒體，能否減輕線粒體DNA損傷，異構體的變化是否與凋亡耐受有關，這些問題還未曾報道，因此這些異構體是否能轉移到線粒體中發揮相應的功能有待研究，線粒體轉移定位以及凋亡的變化將成為下一步探究目標。在順鉑處理下異構體比例的變化可能是一種應對外界刺激細胞耐受相適應的現象，以適應細胞維持基因組穩定的生理功能需要。

[1] Blackburn EH.Telomere states and cell fates[J].Nature, 2000(408):53-56.

[2] Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, et al. The putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization[J].Cell, 1997(90):785-795.

[3] Saeboe-Larssen S, Fossberg E, Gaudernack G.Characterization of novel alternative splicing sites in human telomerase reverse transcriptase (hTERT): analysis of expression and mutual correlation in mRNA isoforms from normal and tumour tissues[J].BMC Molecular Biology, 2006(7):26.

[4] Wojtyla A, Gladych M, Rubis B.Human telomerase activity regulation[J]. Molecular Biology Reports, 2011(38): 3339-3349.

[5] Albert H, Battaglia E, Monteiro CD, et al. Genotoxic stress modulates CDC25C phosphatase alternative splicing in human breast cancer cell lines[J].Molecular Oncology, 2012(6) :542-552.

[6] Listerman I, Sun J, Gazzaniga FS, et al.The major reverse transcriptase-incompetent splice variant of the human telomerase protein inhibits telomerase activity but protects from apoptosis[J]. Cancer Research, 2013(73):2817-2828.

[7] Zhu S, Rousseau P, Lauzon C, et al. Inactive C-terminal telomerase reverse transcriptase insertion splicing variants are dominant-negative inhibitors of telomerase[J].Biochimie, 2014(101) :93-103.

[8] Aravindan N, Veeraraghavan J, Madhusoodhanan R, et al. Curcumin regulates low-linear energy transfer gamma-radiation-induced NFkappaB-dependent telomerase activity in human neuroblastoma cells, International journal of radiation oncology[J].Biology Physics, 2011(79):1206-1215.

[9] Sykorova E, Fajkus J.Structure-function relationships in telomerase genes[J].Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization, 2009 (101):375-392, 371,392.

[10]Hrdlickova R, Nehyba J, Bose HR, et al.Alternatively spliced telomerase reverse transcriptase variants lacking telomerase activity stimulate cell proliferation[J].Molecular and Cellular Biology, 2012(32):4283-4296.

[11]Singhapol C, Pal D, Czapiewski R, et al.Mitochondrial telomerase protects cancer cells from nuclear DNA damage and apoptosis[J].PloS One, 2013(8):e52989.

[12]Sharma GG, Gupta A, Wang H, et al.hTERT associates with human telomeres and enhances genomic stability and DNA repair[J].Oncogene, 2003(22):131-146.

(2016-07-20收稿，2016-10-12修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙 毅

Several Splice Isoforms of hTERT mRNA and Its Change in Cells after Treatment with Cisplatin

YANG Mengli1, CHEN Xiangling1, SUI Xu2, LIAN Yaru1, MA Chunxia1,YAO Yufeng1, SHI Li1, MA Qianli3, YU Jiankun1

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,Yunnan,China; 2.KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650093,Yunann,China; 3.DepartmentofThoracicSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To determine whether there is any change of alternative splicing of hTERT mRNA in lung cancer and cervical cancer cells and human embryonic kidney cells after cisplatin treatment, different dose of cisplatin were used to treat these two types of cell line. Methods: Cultivated lung cancer A549 and H1299 cells, cervical cancer C33A, SiH aand CaSki cells and HEK 293FT cells were divided into experiment group and control group; using cisplatin to treat experiment group cells and DMSO to treat control group cells; hTERT α+β+，α+β-，α-β+，INS3，DEL〗 alternative splicing sites were selected to design primers. Total RNA of treated cells and control cells after treatment with cisplatin were extracted and RT-PCR was used to test the spliced transcripts, and their ratios of hTERT mRNA in cancer cells. Results: The results indicated that the ratio of the hTERT α+β- and INS3 isoform increased with the increase of the concentration of cisplatin; but the change of DEL 〗 was not obvious. Conclusion: The activity of telomerase may be regulated through the expression and ratio of different alternative splicing isoforms of hTERT when DNA impairment.

lung neoplasm; cervical neoplasm; human embryonic kidney cells; cell,cultured; human telomerase reverse transcriptase; cisplatin

中國醫學科學院病原生物學研究所基本科研業務費項目(2012IPB107)； 高等學校博士學科點專項科研基金(新教師類)(20111106120056)

?? E-mail:yjk@imbcams.com.cn

時間：2016-11-15 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.018.html

R512.6

A

1000-2707(2016)11-1279-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.009