稀土離子Tb3+對卵清蛋白穩定性的影響

宋 珍, 董金龍, 任躍紅, 袁 雯, 張彩鳳, 楊斌盛

(1. 太原師范學院化學系, 太原 030012;2. 山西大學分子科學研究所, 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室, 太原 030006;3. 山西省腐植酸工程技術研究中心, 太原 030012)

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稀土離子Tb3+對卵清蛋白穩定性的影響

宋 珍1,3, 董金龍1, 任躍紅1, 袁 雯1, 張彩鳳1,3, 楊斌盛2

(1. 太原師范學院化學系, 太原 030012;2. 山西大學分子科學研究所, 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室, 太原 030006;3. 山西省腐植酸工程技術研究中心, 太原 030012)

卵清蛋白; Tb3+; 穩定性

蛋白質是生物體中的重要物質, 其在生命體中執行生物功能時, 必須維持特定的三維空間結構[1]. 蛋白質從氨基酸序列折疊成具有生物功能的高級結構時受到很多因素的影響, 如鹽的濃度、 溫度、 分子伴侶等[2]. 大多數天然態的蛋白都含有1個疏水中心, 側鏈通過相互堆積作用穩定蛋白質的天然構型, 極性側鏈在外圍與溶劑分子相互接觸. 降低疏水側鏈在水環境中的暴露程度是蛋白質折疊過程的驅動力之一[3]. 蛋白質折疊過程具有高度的復雜性, 使得表征蛋白質部分折疊中間態的構型極其困難[4]. 蛋白質折疊過程中會形成各種中間態, 從一個類似于完全解折疊態的構型到一個類似于天然態的構型[5]. 在天然態和解折疊態之間是否存在或存在多少個中間態引起了科學家的極大興趣. 蛋白質的氨基酸序列決定了蛋白質折疊態到天然態的路徑及天然態的構型. 也有氨基酸序列相同, 但構型不同的蛋白質. 這主要是由于蛋白質的折疊還受到環境因素的影響. 影響蛋白質折疊的作用力主要包括疏水相互作用、 分子間氫鍵和范德華力等[6].

Fig.1 Structure of Ova(PDB 1Ova) drawn by using Pymol software

卵清蛋白(Ova)是典型的球蛋白, 占蛋清蛋白總量的54%～69%, 分子量為44.5×103, 由385個氨基酸殘基組成的單肽鏈組成, 二級結構中包含30.6%α螺旋和31.4%β折疊片[7]. 卵清蛋白是蛋清蛋白中唯一含有自由巰基的蛋白, 這些巰基都被埋藏在蛋白質的疏水核心部分. 卵清蛋白晶體結構顯示其含有3個色氨酸, 可以與鈣離子發生相互作用(圖1).

研究表明[8～10], 在酸度誘導的卵清蛋白解折疊過程中, 當pH=2左右時會出現一個中間態. 本文使用光譜法研究了稀土離子鋱(Tb)與卵清蛋白的相互作用及其對卵清蛋白穩定性的影響. 結果表明, 鋱可以與卵清蛋白以2∶1的比例結合. 通過疏水探針2-對甲苯胺基-6-萘磺酸鈉(TNS)檢測, 鋱結合后使得卵清蛋白的疏水表面暴露程度增加. 化學變性劑尿素誘導卵清蛋白解折疊實驗結果表明, 卵清蛋白的解折疊是一個三態過程. 鋱結合后使得蛋白質穩定性增加.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

七氧化四鋱(Tb4O7)購于天津市化學試劑廠; 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、 磷酸氫二鉀(K2HPO4)、 磷酸二氫鉀(KH2PO4)、 磷酸(H3PO4) 和尿素均購于Sigma公司; 卵清蛋白購于百靈威試劑有限公司, 以上試劑均為分析純.

Varian-Cary Eclipse熒光光譜儀(美國Varian技術有限公司), 激發波長 320 nm, 發射光譜記錄范圍為325～550 nm, 激發、 發射狹縫為 5 nm, 溫度恒定為25 ℃, 所用緩沖溶液為pH=7.4, 10 mmol/L的Hepes; HORIBA-FluoroMax-4型熒光光譜儀(法國HORIBA Jobin Yvon公司), 激發波長 295 nm, 發射光譜記錄范圍為305～600 nm, 激發、 發射狹縫為 5 nm, 溫度恒定為25 ℃, 所用緩沖溶液為pH=7.4的10 mmol/L Hepes; HP 8453型紫外分光光度儀(美國安捷倫有限公司), 光譜記錄范圍為250～400 nm, 溫度恒定為25 ℃, 所用空白樣為pH=7.4的10 mmol/L Hepes緩沖溶液.

1.2 溶液配制與數據處理

Tb3+儲備液的配制: 稱取固定質量的鋱氧化物(Tb4O7), 加入適量的稀鹽酸溶解后用去離子水定容至容量瓶中, 低溫保存. 采用乙二胺四乙酸(EDTA)標準溶液, 用六亞甲基四胺溶液作為緩沖液, 二甲酚橙為指示劑標定Tb3+儲備液.

TNS儲備液的配制: 稱取一定質量的TNS固體, 加入蒸餾水微熱溶解后定容至棕色容量瓶中, 避光保存.

兩態解折疊曲線按照線性外推法處理, 三態的解折疊曲線按照結構基元模型處理數據[11,12].

Fig.2 Fluorescence spectra of Ova at different concentrations of Tb3+ in pH=7.4, 10 mmol/L Hepes(A) and titration curve of Ova with Tb3+ addition(B)

2 結果與討論

2.1 卵清蛋白與鋱離子的結合性質

2.1.1 Tb3+敏化的熒光光譜 在pH=7.4的10 mmol/L Hepes緩沖溶液中, 用Tb3+滴定Ova, 結果如圖2(A)所示. Tb3+的敏化熒光峰出現在490, 545 nm附近, 是由鋱的5D4到7F6,7F5的躍遷引起的. 隨著Tb3+的逐漸滴加, Tb3+的敏化熒光峰逐漸增強. 用[Tb3+]/[Ova]作為橫坐標對Tb3+在545 nm處的熒光強度作圖. 由圖2(B)可以看出, 當[Tb3+]/[Ova]<0.5時, Tb3+在545 nm波長下的熒光強度變化較小; 當[Tb3+]/[Ova]>0.8時, 其在545 nm處的熒光強度急劇增大; 當[Tb3+]/[Ova]達到2.0時, Tb3+在545 nm處的熒光強度幾乎不再增加. 由滴定曲線可知, Ova可以與Tb3+形成1∶2的復合物.

Tb3+熒光峰的敏化主要是由蛋白質中發光氨基酸(酪氨酸、 色氨酸、 苯丙氨酸)對其能量轉移引起的[13,14]. 由圖2(B)可以看出, 鋱與蛋白質的結合出現兩類結合位點: 第一類結合位點結合能力強, 但

敏化較弱, 熒光增強緩慢; 第二類結合位點結合能力弱, 但敏化較強, 熒光增強迅速. 第一階段熒光緩慢增強主要是由于Tb3+主要結合在離主要的發光氨基酸色氨酸較遠的地方, 沒有發生合適的能量轉移造成的; 而后一階段Tb3+與色氨酸發生了合適的能量轉移. 此外, 用Ca2+溶液滴定Tb3+飽和的蛋白質溶液, 發現Tb3+的熒光敏化峰逐漸減弱, 推測Tb3+可能與Ca2+具有相同的結合位點.

2.1.2 Tb3+引起的蛋白構象變化 TNS是疏水探針, 它在極性環境只有很微弱的熒光, 當周圍環境變為疏水環境時, 其熒光強度大幅增強. 室溫下, 在pH=7.4, 10 mmol/L Hepes緩沖溶液中, 用TNS滴定蛋白, 結果如圖3(A)所示. 可見, 隨著TNS滴加量的增加, 其在440 nm處的熒光峰逐漸增強. 用[TNS]/[Ova]對440 nm處的熒光強度作圖, 結果如圖3(B)所示. 可以看到TNS與Ova的結合比為1∶1. 在固定結合比的基礎上, 用Tb3+滴定蛋白與TNS的復合物, 結果如圖3(C)所示. 可見, 隨著Tb3+滴加量的增加, TNS在440 nm處的熒光強度繼續增強. 這是由于Tb3+與蛋白質的結合使得蛋白質的疏水區域暴露程度增大, 從而使得TNS的熒光增強. 當Tb3+與Ova的摩爾比超過2時, TNS的峰幾乎不再隨Tb3+滴加量的增加而增強. 這也表明, Tb3+可與蛋白形成1∶2的復合物, 并且Tb3+的結合可以使得蛋白質的疏水區域暴露程度增大.

Fig.3 Fluorescence spectra of Ova at different concentrations of TNS in the absence of Ova, in pH=7.4, 10 mmol/L Hepes(A), titration curve of Ova with TNS addition(B) and fluorescence spectra of TNS with the addition of Tb3+ in the presence of Ova in pH=7.4, 10 mmol/L Hepes(C)

Fig.4 Fluorescence spectra for protein in different concentrations of urea(A) and the unfolding curves of Ova(a), Ova-Ca2+(b), Ova-Tb3+(c) induced by urea(B)

2.2 蛋白質的穩定性

卵清蛋白在天然狀態下的最大發射波長為335 nm, 是由于其色氨酸殘基處在較疏水的環境中. 隨著尿素(化學變性劑)的加入, 蛋白質的熒光峰逐漸從335 nm移動至358 nm, 如圖4(A)所示. 可見, 隨著尿素的加入, 蛋白質逐漸失去其天然結構, 原來處于較疏水環境中的色氨酸殘基逐漸暴露在水溶液環境中. 用380 nm處的熒光強度與325 nm處的熒光強度比值(I380 nm/I325 nm)對[Urea]作圖得到蛋白質的解折疊曲線, 結果如圖4(B)所示. 利用蛋白質的解折疊百分數(Yapp)衡量蛋白質的解折疊程度.

Table 1 Thermodynamics parameters of proteins from urea-induced unfolding at pH=7.4 and 25 ℃*

Fig.5 Temperature induced unfolding of Ova, Ova-Ca2+, Ova-Tb3+ in pH=7.4, 10 mmol/L Hepes

圖5為溫度引起的蛋白質、 鈣結合蛋白和鋱結合蛋白的解折疊曲線, 可以看到蛋白的解折疊同樣也呈現三態. 這也與脲變性得到的結論相吻合. 這3個蛋白的中間態均出現在60 ℃附近.

Table 2 Thermal denaturation parameters of proteins at pH=7.4 and 25 ℃*

[1] Buck M., Radford S. E., Dobson C. M.,J.Mol.Biol., 1994, 237(3), 247—254

[2] Tsytlonok M., Itzhaki L. S.,Arch.Biochem.Biophys., 2013, 531(1—2), 14—23

[3] Dobson C. M.,Nature, 2003, 426(6968), 884—890

[4] Arai M., Kuwajima K.,Adv.ProteinChem., 2000, 53, 209—282

[5] Neudecker P., Robustelli P., Cavalli A., Walsh P., Lundstr?m P., Zarrine-Afsar A., Sharpe S., Vendruscolo M., Kay L. E.,Science, 2012, 336(6079), 362—366

[6] Jones S., Reader J. S., Healy M., Capaldi A. P., Ashcroft A. E., Kalverda A. P., Smith D. A., Radford S. E.,Biochemistry, 2000, 39(19), 5672—5682

[7] Stein P. E., Leslie A. G., Finch J. T., Carrell R. W.,J.Mol.Biol., 1991, 221(3), 941—959

[8] Ferreira M. F., Coimbra J. S. R., Garcia R. E. E., Minim L. A., Oliveira F. C., Sousa R. d. C. S.,LWT-FoodSci.Technol., 2007, 40(7), 1304—1307

[9] Ahmad F., Salahuddin A.,Biochemistry, 1976, 15(23), 5168—5175

[10] Naeem A., Khan T. A., Muzaffar M., Ahmad S., Saleemuddin M.,CellBiochem.Biophys., 2011, 59(1), 29—38

[11] Song Z., Ming J., Yang B.,J.Biol.Inorg.Chem., 2014, 19(3), 359—374

[12] Yang B. S., Song Z., Zheng X. Y. A.,Sci.ChinaChem., 2012, 55(7), 1351—1357

[13] Zhang J., Chen W. X., Zhang W., Duan Y., Zhu Y. X., Zhu Y. X., Zhang Y.,Chem.J.ChineseUniversities, 2015, 36(8), 1511—1516(張靜, 陳薇曉, 張唯, 段瀅, 朱玉秀, 朱亞先, 張勇. 高等學校化學學報, 2015, 36(8), 1511—1516)

[14] Yang S. L., Song P., She W. J., Yang T. L.,Chem.J.ChineseUniversities, 2015, 36(7), 1254—1263(楊水蘭, 宋盼, 佘文潔, 楊天林. 高等學?；瘜W學報, 2015, 36(7), 1254—1263)

(Ed.: F, K, M)

Effect of Tb3+on the Stability of Ovalbumin?

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21571117), the Returned Oversea Fund of Shanxi Province, China(No.2011085) and the Innovation Project of Undergraduate of Shanxi Normal University, China(No.CXCY1629).

SONG Zhen1,3, DONG Jinlong1, REN Yuehong1, YUAN Wen1, ZHANG Caifeng1,3, YANG Binsheng2*

(1.DepartmentofChemistry,TaiyuanNormalUniversity,Taiyuan030012,China;2.InstituteofMolecularScience,KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineeringofMinistryofEducation,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;3.HumicAcidEngineeringandTechnologyResearchCenterofShanxiProvince,Taiyuan030012,China)

Ovalbumin; Tb3+; Stability

2016-04-20.

日期: 2016-06-30.

國家自然科學基金(批準號: 21571117)、 山西省留學歸國基金(批準號: 2011085)和太原師范學院大學生創新項目(批準號: CXCY1629)資助.

10.7503/cjcu20160259

O614; O629.73

A

聯系人簡介: 楊斌盛, 男, 教授, 主要從事生物無機化學研究. E-mail: yangbs@sxu.edu.cn