膠體金免疫層析試驗(yàn)檢測(cè)乙肝兩對(duì)半時(shí)HBsAg假陰性結(jié)果的處置*

王洪珍，陳小芳，錢粉紅

(1.江蘇省鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院生殖中心 212001；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

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·臨床研究·

膠體金免疫層析試驗(yàn)檢測(cè)乙肝兩對(duì)半時(shí)HBsAg假陰性結(jié)果的處置*

王洪珍1，陳小芳1，錢粉紅2△

(1.江蘇省鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院生殖中心 212001；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的 膠體金免疫層析試驗(yàn)(GICA)檢測(cè)乙肝兩對(duì)半時(shí)，對(duì)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)結(jié)果疑似假陰性的標(biāo)本分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)定量試驗(yàn)進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，并用抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，以獲得一個(gè)處理GICA檢測(cè)HBsAg產(chǎn)生假陰性結(jié)果的可靠方法。方法 2014年1月至2015年2月用GICA檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的標(biāo)本3 078例，選取其中結(jié)果為單乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)，或單乙型肝炎e抗體(抗-HBe)為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)均為陰性的標(biāo)本86例，分別用ELISA和TRFIA檢測(cè)其HBsAg，對(duì)檢測(cè)為陽性的標(biāo)本進(jìn)行抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)。結(jié)果 86例標(biāo)本經(jīng)抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)陽性的為35例；ELISA檢出陽性標(biāo)本28例，其中2例為假陽性 ；TRFIA檢出陽性標(biāo)本35例與抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)符合率100%。結(jié)論 GICA檢測(cè)乙肝兩對(duì)半時(shí)，對(duì)HBsAg結(jié)果疑似假陰性的標(biāo)本可選用TRFIA進(jìn)行復(fù)查確認(rèn)。

乙型肝炎表面抗原； 膠體金免疫層析試驗(yàn)； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)； 時(shí)間分辨免疫熒光分析試驗(yàn)； 抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)

乙型肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)在我國的發(fā)病率很高，乙肝表面抗原(HBsAg)是診斷HBV感染的重要標(biāo)志物，HBsAg檢查對(duì)乙肝的預(yù)防和治療有重要意義[1]。目前檢測(cè)HBV標(biāo)志物的方法較多，鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院門急診患者常用膠體金免疫層析試驗(yàn)(GICA)檢測(cè)乙肝兩對(duì)半，GICA 雖然方便快速，但該方法靈敏度不高，對(duì)低濃度的HBsAg會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為獲得一個(gè)處理GICA檢測(cè)HBsAg產(chǎn)生假陰性結(jié)果的可靠方法，本文對(duì)GICA檢測(cè)乙肝兩對(duì)半時(shí)，HBsAg結(jié)果疑似假陰性的標(biāo)本分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)定量試驗(yàn)進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，并用抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1．1 標(biāo)本來源 2014年1月至2015年2月鎮(zhèn)江市第四人民醫(yī)院共有3 078例患者靜脈血清用GIA檢測(cè)乙肝兩對(duì)半，選取其中單乙肝核心抗體(抗-HBc)，或單乙肝e抗體(抗-HBe)為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、乙肝表面抗體(抗-HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)均為陰性的標(biāo)本，其中單抗-HBc陽性標(biāo)本44例，單抗-HBe陽性標(biāo)本3例，抗-HBc和抗-HBe同為陽性標(biāo)本39例，共計(jì)86例。

1．2 儀器與試劑 全自動(dòng)時(shí)間分辨免疫熒光儀EasyCuta，BIO-RAD model 550酶標(biāo)儀，洗板機(jī)。GICA乙肝兩對(duì)半測(cè)試卡為愛博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司提供,ELISA)試劑盒由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供,TRFIA定量檢測(cè)試劑為蘇州新波生物技術(shù)有限公司提供,HBsAg抗體中和確認(rèn)試劑盒由珠海麗珠試劑股份有限公司提供。

1．3 方法 各方法嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行操作。GICA 在10 min和30 min各觀測(cè)一次結(jié)果,以后者報(bào)告結(jié)果，30 min后判定無效。ELISA測(cè)定時(shí)，用洗板機(jī)洗板，用酶標(biāo)儀測(cè)定各A 值，按盒內(nèi)說明書計(jì)算Cutoff 值；每板設(shè)空白1 孔，陰、陽性對(duì)照血清各兩孔；陰性對(duì)照孔A值≤0.10，陽性對(duì)照孔A值≥0.80，否則實(shí)驗(yàn)無效；陰性對(duì)照孔A值<0.05按0.05計(jì)算。TRFIA操作前按要求做好標(biāo)準(zhǔn)曲線,并作室內(nèi)質(zhì)量控制。HBsAg最終結(jié)果以HBsAg抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，HBsAg抑制率≥50%為陽性。檢測(cè)流程：首先進(jìn)行GICA乳膠板檢測(cè)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物，篩選其單抗-HBc，或單抗-HBe為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、抗-HBs、HBeAg均為陰性的標(biāo)本，再用ELISA和TRFIA定量試驗(yàn)進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)為陽性的標(biāo)本進(jìn)行HBsAg抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)。

2 結(jié) 果

2.1 HBsAg確認(rèn)試驗(yàn)對(duì)ELISA和TRFIA檢測(cè)HBsAg陽性結(jié)果的確認(rèn) 入選的86例標(biāo)本中，GICA結(jié)果為抗-HBc和抗-HBe同為陽性標(biāo)本39例，經(jīng)ELISA檢測(cè)HBsAg為陽性的17例，經(jīng)TRFIA檢測(cè)HBsAg為陽性的20例；GICA結(jié)果為單抗-HBc陽性標(biāo)本44例，經(jīng)ELISA檢測(cè)HBsAg為陽性的8例，經(jīng)TRFIA檢測(cè)HBsAg為陽性的12例；GICA結(jié)果為單抗-HBe陽性標(biāo)本3例，經(jīng)ELISA檢測(cè)HBsAg為陽性的3例，經(jīng)TRFIA檢測(cè)HBsAg為陽性的3例。ELISA檢測(cè)為陽性的合計(jì)28例占32.56%(28/86)，TRFIA檢測(cè)為陽性的合計(jì)為35例占40.70%(35/86)，兩種方法共檢測(cè)出HBsAg陽性標(biāo)本37例，經(jīng)HBsAg抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)為陽性的為35例，見表1。

表1 HBsAg確認(rèn)試驗(yàn)對(duì)ELISA和TRFIA檢測(cè)HBsAg陽性結(jié)果的確認(rèn)(n)

2.2 HBsAg TRFIA定量試驗(yàn)陰性的標(biāo)本進(jìn)一步檢測(cè)分析結(jié)果 對(duì)51例TRFIA HBsAg定量試驗(yàn)陰性標(biāo)本進(jìn)一步檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)有29例抗-HBs陽性，占33.72%(29/86)。

3 討 論

GICA 檢測(cè)乙肝兩對(duì)半具有方便快速、干擾因素少，可單個(gè)標(biāo)本操作等優(yōu)點(diǎn)，能滿足急診檢驗(yàn)的需要，為門診、急診患者和無償獻(xiàn)血現(xiàn)場(chǎng)采血前檢測(cè)乙肝標(biāo)志物提供了便利條件。但是該方法靈敏度不高，HBsAg的檢測(cè)限一般為1 ng/mL，對(duì)于HBsAg弱陽性標(biāo)本的檢出率不高，容易出現(xiàn)假陰性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，入選的86例疑似HBsAg假陰性標(biāo)本，最終確認(rèn)有35例為HBsAg弱陽性，占40.70%(35/86)，對(duì)51例HBsAg陰性標(biāo)本進(jìn)一步檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)還有29例抗-HBs弱陽性，占33.72%(29/86)，因此GICA檢測(cè)乙肝兩對(duì)半，只能作為篩查方法，對(duì)于疑似HBsAg假陰性標(biāo)本需要用更準(zhǔn)確的方法進(jìn)行復(fù)查后方能發(fā)出報(bào)告。

ELISA靈敏度較高、特異性較好，操作方便且不需要很精貴的儀器，各診斷指標(biāo)都比較理想且成本較低,基本滿足了臨床需求，是目前國內(nèi)基層醫(yī)院檢測(cè)HBsAg最常用的方法。但該方法的操作步驟較多，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程持續(xù)時(shí)間長，而且國產(chǎn)ELISA試劑盒的靈敏度一般在0.5 ng/mL，對(duì)HBsAg臨界標(biāo)本檢測(cè)的正確率并不理想，對(duì)一些低水平的HBsAg檢出能力有限，仍有漏檢，會(huì)產(chǎn)生一定的假陰性。在本實(shí)驗(yàn)中，最終確認(rèn)的35例HBsAg弱陽性標(biāo)本，ELISA僅檢出26例陽性。標(biāo)本溶血、標(biāo)本污染、標(biāo)本放置過久、標(biāo)本凝集不全、操作中的因素(孵育時(shí)間、洗板、加樣量等)都有可能造成ELISA結(jié)果為假陽性。在本實(shí)驗(yàn)中，ELISA檢出的28例HBsAg弱陽性標(biāo)本，有2例為假陽性。

TRFIA HBsAg定量試驗(yàn)HBsAg檢測(cè)的靈敏度、特異性明顯提高，使HBsAg滴度表達(dá)很低的標(biāo)本得以檢出,靈敏度一般在0.2 ng/mL，并能檢測(cè)變異的HBsAg，對(duì)臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查有著重要意義。全自動(dòng)時(shí)間分辨免疫熒光儀EasyCuta從標(biāo)本加樣到結(jié)果全部由儀器自動(dòng)化完成，從而避免了人為誤差產(chǎn)生，做到了自動(dòng)、準(zhǔn)確、快速。有研究者提出，對(duì)于低濃度的HBsAg應(yīng)引起足夠的重視[2-5]。本實(shí)驗(yàn)中，HBsAg水平低的標(biāo)本，GICA和ELISA靈敏度不夠而漏檢的，經(jīng)TRFIA檢測(cè)后均被檢出，并經(jīng)HBsAg抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)最終確認(rèn)，符合率100%。李金明[3]提出應(yīng)重視對(duì)弱反應(yīng)性標(biāo)本的確認(rèn)，排除假陽性，得出一個(gè)正確的結(jié)果，對(duì)患者負(fù)責(zé)。 ELISA不僅因靈敏度的原因會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且存在一定程度的假陽性，在操作中需要注意防范，對(duì)弱陽性標(biāo)本也需要進(jìn)一步復(fù)查確認(rèn)，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。曹樹正等[6]曾以微粒子酶免發(fā)光法(MEIA)來確認(rèn)ELISA檢測(cè)HBsAg產(chǎn)生假陰性的標(biāo)本，經(jīng)抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)，MEIA也存在一定的假陽性，其低反應(yīng)標(biāo)本仍要經(jīng)過抗體中和確認(rèn)試驗(yàn)來驗(yàn)證。而TRFIA結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好，對(duì)HBsAg弱陽性標(biāo)本有較好的檢出率，檢測(cè)變異的HBsAg能力也強(qiáng)。因此，GICA對(duì)乙肝兩對(duì)半檢測(cè)時(shí)，對(duì)其中單抗-HBc陽性，或單抗-HBe為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、抗-HBs、HBeAg均為陰性的疑似HBsAg假陰性標(biāo)本可用TRFIA HBsAg定量試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)確認(rèn)，核定結(jié)果后再發(fā)正式報(bào)告。

[1]王海剛，丁磊，潘航，等.3種HBsAg檢測(cè)方法的比較[J]．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014,35(12):1614-1615.

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[4]李金明．感染性疾病血清學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)重視對(duì)弱反應(yīng)性標(biāo)本的確認(rèn)[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(7)：577-580．

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370119)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.036

A

1673-4130(2016)23-3333-02

2016-06-12

2016-09-02)

△通訊作者，E-mail:zhaoqian604@126.com。