羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀檢測抗繆勒管激素的方法學評價

曾 玉，吳 畏，姚 輝，嚴忠亞，鐘天鷹

(江蘇省南京市婦幼保健院檢驗科 210004)

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·臨床研究·

羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀檢測抗繆勒管激素的方法學評價

曾 玉，吳 畏，姚 輝，嚴忠亞，鐘天鷹

(江蘇省南京市婦幼保健院檢驗科 210004)

目的 對羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀檢測抗繆勒管激素(AMH)進行方法學評價。方法 根據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)的EP文件要求，制訂定量檢測方法的方法學評價方案，即通過在羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀檢測AMH的精密度、準確度、分析測量范圍和攜帶污染率來評價其性能。結果 AMH低、中和高濃度時，批內精密度CV分別是1.971%、1.540%和1.707%，批間精密度CV分別為3.508%、3.072%和3.199%，均符合要求；多個不同濃度定值校準品的檢測結果與靶值的相對偏倚均在±5%之內，且將已知濃度的AMH標本加入到健康人血清中，測得的添加回收率為97.05%～102.52%，準確度滿足判斷標準；分析測量線性范圍為0.083～22.398 ng/mL，相關方程Y=0.987 7X+0.100 6(a值在0.95～1.05，r2≥0.95)；攜帶污染率為0.769%(≤2.0%)。結論 羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀檢測AMH的精密度高、準確度好，具有良好的線性測量范圍及攜帶污染率低，驗證和評價標準符合，可為臨床檢測工作提供準確的參考依據。

Cobas E602； 電化學發光； 抗繆勒管激素； 方法學評價

抗繆勒管激素(AMH)是Jost于1947年首先在睪丸支持細胞內發現的。AMH是轉化生長因子β超家族的生長和分化的反應調節劑的一個成員，在卵巢功能方面發揮著極其重要的作用，如評估卵巢儲備功能，預測絕經年齡等。此外，AMH可為輔助生殖技術的個性化治療提供可靠證據，可對卵泡池中的卵子數量與質量及卵巢反應性進行評估并預測卵巢過度刺激綜合征的發生，在生殖領域中也有著廣闊的應用前景。AMH正作為臨床常用的生化指標，受到極度關注與應用[1-2]。德國羅氏公司研制的電化學發光法檢測AMH為新近批準項目可進入臨床應用，本科室最近引進該檢測項目，現就羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀檢測血清AMH的方法學進行評價，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2015年10～12月門、急診及住院患者的新鮮血清標本，分別混合低、中、高3種濃度水平血清用于批內和批間精密度、準確度、添加回收率、分析測量范圍以及攜帶污染率評價。

1.2 儀器與試劑 儀器采用德國羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀，使用配套AMH試劑。

1.3 評價方案與實驗方法

1.3.1 精密度評價 參照美國臨床和實驗室標準協會(NCCLS)的EP-5A評價方案[3]，使用Elecsys試劑、標本和質控品確定精密度。具體為常規IQC在控后按標本檢測程序進行測定，選擇收集的低、中和高3種濃度混合血清標本，1 d內連續重復測定20次，分別計算出批內精密度的標準差(S批內) 和變異系數(CV批內)；另將上述3種濃度的混合血清連續重復測定20 d，每天上下午各測定1次，分別計算出批間精密度的標準差(S批間)和變異系數(CV批間)。

1.3.2 準確度評價 參照NCCLS的EP15-A[4]評價方案，按照檢測定值的參考物質計算偏差來驗證：即將AMH校準品稀釋至5個不同濃度，每個濃度校準品連續測定2次，計算結果均值，對檢測結果與已知的“靶值”進行比對，計算檢測值與靶值的相對偏倚(%)，計算公式：偏倚=(測定值-靶值)/靶值×100%，偏倚應小于或等于5.0%。將一定濃度的AMH標本加入到正常人血清中，計算添加回收率。

1.3.3 分析測量范圍(AMR)評價 按照NCCLS的EP6-A文件[5]，先確定實驗室AMH測定的重復性和線性的允許誤差范圍分別為2%和5%；再選擇AMH濃度靠近廠家提供線性范圍上限的患者血清標本作為高濃度血清(H)，AMH濃度低的患者血清標本作為低濃度血清(L)，按5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L和5L的關系各自配制，形成系列濃度檢測標本，用Cobas E602對系列濃度標本進行AMH檢測，每個濃度水平測定2次，記錄結果，對檢測結果的均值和理論值進行直線回歸統計。實測值與理論值作比較(偏離應小于10%)，以稀釋后的理論值為橫坐標X，實測值的平均濃度為縱坐標Y，數據采用直線回歸統計處理，計算回歸方程：Y=aX+b和相關系數r2，若a值在1±0.05范圍內，且r2≥0.950，則可為真實的測量分析范圍，作臨床參考依據。

1.3.4 攜帶污染率的評價 取高濃度AMH血清標本連續測定3次，測定值分別為H1、H2、H3；再取低濃度HE4血清標本連續測定3次，測定值分別為L1、L2、L3，按公式計算攜帶污染率。攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。攜帶污染率應小于等于2.0%。

2 結 果

2.1 AMH精密度評價結果 參考NCCLS的EP-5A文件，用收集的低、中、高3種濃度混合血清做批內精密度和批間精密度，見表1。

表1 Cobas E602測定AMH的精密度評價結果

2.2 AMH準確度評價結果 參考NCCLS EP15-A文件，與AMH校準品的標定值相比，驗證值的相對偏倚在±5%之間，見表2。

表2 Cobas E602測定AMH的準確度評價結果

將已知濃度的AMH標本加入到健康人血清中，測得的添加回收率為97.05%～102.52%。

2.3 AMH分析測量范圍評價結果 選取AMH高濃度(22.398 ng/mL)和低濃度(0.083 ng/mL)血清，根據配制關系稀釋并計算出6例標本的AMH水平，作為這些標本的理論預期值，以預期值為橫坐標，實測均值為縱坐標，將實測值與理論值作比較(偏離應小于10%)，進行直線回歸分析，觀察其線性范圍，計算Y=aX+b，結果顯示a=0.987 7，r2=0.999 6，滿足要求(a值在1±0.05范圍內，相關系數r2≥0.95)，見表2，散點圖見圖1。因此，AMH濃度在0.083～22.398 ng/mL范圍內線性良好。

表3 AMH分析測量范圍評價

圖1 AMH線性范圍驗證

2.4 AMH攜帶污染率結果 AMH的H1、H2、H3測定值分別是22.429、22.391和22.763 ng/mL；L1、L2、L3測定值分別是0.409、0.285和0.237 ng/mL。攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%，計算得0.769%，攜帶污染率滿足要求。

3 討 論

AMH檢測是在羅氏公司Cobas e602型全自動電化學發光免疫分析儀進行檢測，該試劑盒為羅氏公司研發的采用電化學發光免疫法(ECLIA)測定。ECLIA是在電場作用下發生的化學發光反應，是電化學和免疫測定技術相結合的產物，是目前全球最先進的免疫標記分析技術之一。ECLIA基本原理為電化學發光過程產生的光信號強度與二價的三氯聯吡啶釕[Rubpy3]2+的濃度呈線性關系。將二價的三氯聯吡啶釕[Rubpy3]2+與免疫反應體系中的一種物質結合，經免疫反應、分離后，檢測免疫反應體系中剩余二價的三氯聯吡啶釕[Rubpy3]2+經上述過程后所發出的光，即可得知待檢物的濃度。ECLIA技術是目前最先進的標記免疫測定技術之一，具有準確度高、靈敏度高、穩定性好、無放射性污染，而且操作簡便，可實現完全自動化，檢測速度快等特點，與傳統的檢測方法相比具有無可比擬的優越性[6]。

雖然Cobas E601檢測系統為封閉系統，采用配套的試劑、質控品和標準品，但是每個實驗室在水質、電壓穩定性、實驗室溫濕度和人員操作習慣等條件方面存在差異，實際分析性能與廠家提供的性能參數不一定一致。因此，根據《醫療機構臨床實驗室管理方法》和《ISO15189:2008 醫學實驗室質量和能力認可準則》對目前臨床實驗室質量要求[7]，臨床實驗室在開展新的檢測項目之前需對新檢測系統(儀器、試劑、校準品等)進行必要的性能驗證，確保檢驗系統可對臨床應用滿意，確保可靠性，方法學評價內容在操作過程中通常包括可報告的精密度、準確度、攜帶污染率等，其中準確度和精密度的測定為最主要的驗證指標[3-4]。本研究通過Cobas E602檢測系統測定AMH的相關性能指標進行檢測，以驗證廠家給定的AMH性能參數并評估AMH作為新的檢測項目在臨床應用的可行性。

根據NCCLS的EP-5A文件對批內和批間精密度的評估，結果顯示AMH低、中和高濃度時，批內精密度CV分別是1.971%、1.540%和1.707%，批間精密度CV分別為3.508%、3.072%和3.199%，與羅氏廠家說明書提供的參數基本相同，且符合CLSI的EP-5A文件標準，表明該方法穩定性和重復性均很好，精密度屬于可接受范圍。根據EP15-A文件，選擇AMH校準品的不同稀釋濃度作為參考物質，每個濃度校準品連續測定2次，計算結果均值，對檢測結果與已知的“靶值”進行比對，計算檢測值與“理論靶值”的相對偏倚(%)，結果5個不同濃度的AMH樣品相對偏倚均在±5.0%之內，滿足要求，表明準確度可接受。

按照NCCLS EP6-A文件評價AMH的分析測量范圍，用以驗證該方法的高、低檢測值之間是否呈線性關系，將高值和低值AMH標本按不同關系各自配制并根據各稀釋點數據進行直線回歸統計方法處理，得方程Y=0.990 3X+0.018 9，r2=0.999 6，可見a值在規定的0.95～1.05范圍內，且r2≥0.95，表明AMH在0.083～22.398 ng/mL范圍呈較好的線性相關，此可為真實實施的測量分析范圍，為臨床提供參考依據。但此線性范圍的低值為0.083 ng/mL，略高于羅氏公司給予的AMH低值0.01 ng/mL，亦表明不同實驗室之間存在差異。本研究將已知濃度的AMH標本加入到正常人血清中，測得的添加回收率為97.05%～102.52%，符合要求。另外，由于羅氏公司Cobas E602采用一次性加樣系統，大大減少了攜帶污染，檢測結果顯示該系統攜帶污染率僅為0.769%。

綜上所述，應用羅氏公司Cobas E602電化學發光分析儀檢測AMH，精密度和準確度高，具有良好的線性測量范圍及攜帶污染率低，驗證和評價標準符合，可為臨床檢測工作提供準確的參考依據。

[1]王巧麗，舒婷婷，陳曉紅，等．抗苗勒管激素與卵巢儲備功能關系的研究進展[J]．國際檢驗醫學雜志，2015，36(1)：104-105．

[2]Jamil Z,Fatima SS,Ahmed K,et al.Anti-Mullerian hormone:above and beyond conventional ovarian reserve markers[J].Dis Markers,2016，2016(3):1-9.

[3]NCCLS.EP5-A Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices:approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,1999.

[4]NCCLS.EP15-A User demonstration of performance for precision and accuracy:approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2001.

[5]NCCLS.EP6-A Evaluation of linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2003.

[6]田潤華，鄭春喜，王士珍．電化學發光免疫分析與臨床應用[J]．齊魯醫學雜志，2004，19(5)：464-465．

[7] 中華人民共和國衛生部.醫療機構臨床實驗室管理辦法[S].北京:衛生部,2006:6．

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.039

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1673-4130(2016)23-3338-03

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2016-09-08)