實時熒光核酸恒溫擴增技術在解脲脲原體檢測中的應用

陳小波，朱慶文，徐愛萍，蘇良香，費倩倩

(江蘇省南通市婦幼保健院：1.產前診斷中心；2.生殖助孕中心 226001)

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·臨床研究·

實時熒光核酸恒溫擴增技術在解脲脲原體檢測中的應用

陳小波1，朱慶文1，徐愛萍1，蘇良香1，費倩倩2△

(江蘇省南通市婦幼保健院：1.產前診斷中心；2.生殖助孕中心 226001)

目的 應用實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(SAT)對不孕不育癥患者的泌尿生殖道拭子及尿液進行解脲脲原體(UU)檢測，并評價其敏感性和特異度。方法 對452例不孕不育癥患者的泌尿生殖道拭子標本，采用SAT檢測法、培養法、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)進行UU檢測，同時再對同一患者的尿液標本進行SAT檢測，根據實驗結果評估SAT在拭子及尿液標本UU檢測中的靈敏度和特異度；同時UU培養陽性的標本經過臨床UU規范治療后，仍采用上述方法對患者進行UU復查，根據實驗結果評估SAT在UU檢測中的判斷預后效果。結果 初檢時與UU培養結果作比較，UU-SAT拭子標本的檢測靈敏度為97.1%(170/175)，特異度為97.8%(271/277)，差異無統計學意義(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液標本的檢測靈敏度為96.0%(168/175)，特異度為98.9%(274/277)，差異無統計學意義(χ2=0.163 5，P=0.686 0)。結論 SAT檢測泌尿生殖道患者拭子及尿液UU檢測具有很高的靈敏度和特異性，同時又有很好的判愈效果，為UU的臨床實驗室診斷提供了新的檢測手段。

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術； 解脲脲原體； 尿液檢測； 聚合酶鏈反應

解脲脲原體(UU)是一類原核細胞型微生物，是泌尿生殖道感染的常見病原體之一，它不僅引起非淋菌性尿道炎，還可引起多種泌尿生殖道疾病，如前列腺炎、附睪炎、宮頸炎、輸卵管炎及其導致的輸卵管妊娠等，是導致不孕不育癥的重要原因之一。近年來，隨著不孕不育癥發病率的逐漸上升，UU引起的生殖道感染日益受到關注。本文采用實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(SAT)對患者的泌尿生殖道拭子及尿液標本進行UU的RNA檢測。SAT技術是建立在RNA恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術基礎上的第二代核酸檢測技術?，F將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 所有452例患者標本均為2015年9月至2016年2月來本院生殖助孕中心就診并計劃行體外受精聯合胚胎移植(IVF)手術的患者，其中男125例，女327例，年齡23～45歲，男性取尿道拭子及尿樣,女性取宮頸拭子及尿樣。

1.2 標本采集 拭子標本采集：用醫用棉拭子伸入男性尿道口或女性宮頸口約1～2 cm，旋轉1周，停留10 s后取出，并將拭子頭放入1 mL生理鹽水浸泡貼管壁擠干，取0.5 mL加入0.5 mL專用尿液保存液混勻，立即檢測或-20 ℃保存待測。尿液標本采集：取清晨首次尿，或長時間(至少1 h)不排尿后的首段尿1 mL加入1 mL專用尿液保存液混勻，立即檢測或-20 ℃保存待測。

1.3 試劑與儀器 UU核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增)和專用磁珠分離裝置(上海仁度生物科技有限公司)；UU核酸擴增聚合酶鏈反應(PCR)熒光定量檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)；UU培養鑒定藥敏試劑盒(珠海麗珠試劑有限公司)；ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀。

1.4 方法 同一患者拭子用培養法檢測，尿液用SAT進行檢測，若同一患者培養和SAT檢測結果不一致，用PCR法對留存的拭子標本進行復測，操作嚴格按照說明書進行。

1.5 標本檢測 同一患者收集到的3份拭子標本分別做UU培養、UU-PCR及UU-SAT，尿液標本只做UU-SAT。若培養檢測陽性，根據臨床規范化治療后，再次采集治療后患者的生殖道拭子及尿液標本，采用初檢時檢測的方法和步驟進行復檢。

1.6 統計學處理 采用SPSS13．0統計軟件進行處理。計數資料以率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 452例初檢結果 與UU培養結果作比較，UU-SAT拭子標本的檢測靈敏度為97.1%(170/175)，特異度為97.8%(271/277)，差異無統計學意義(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液標本的檢測靈敏度為96.0%(168/175)，特異度為98.9%(274/277)，差異無統計學意義(χ2=0.163 5，P=0.686 0)，見表1。

2.2 療效判愈實驗室指標分析 對175例UU-培養陽性患者進行臨床規范治療后再次采集標本，按原方法進行復檢，與UU培養結果作比較，UU-SAT拭子標本的檢測靈敏度為97.8%(44/45)，特異度為99.2%(129/130)；UU-SAT尿液標本的檢測靈敏度為93.3%(42/45)，特異度為98.5%(128/130)，見表2。

表1 452例患者初檢3種方法的檢測結果(n)

表2 175例“培養初檢陽性”患者規范治療后的復檢結果(n)

3 討 論

UU是一類大小介于細菌和病毒之間的沒有細胞壁的原核細胞微生物，是人類泌尿生殖道的常見病原體之一，也是育齡夫婦不孕不育的重要原因之一[1-3]。目前，UU臨床檢測主要有培養法和熒光定量PCR法，兩種檢測方法的標本來源均取自患者的泌尿生殖道分泌物，侵入式取樣，容易增加患者的抵觸情緒。同時培養法檢測對標本的采集和保存要求都很高，存在培養時間長、主觀判讀，靈敏度和特異度都有所不足。SAT是采用RNA恒溫擴增技術原理，結合實時熒光檢測的一種新的RNA檢測技術。本文使用SAT技術對患者拭子及尿液標本進行UU RNA檢測，結果顯示SAT法具有很高的靈敏度和特異度，同時又有很好的判愈效果。實驗表明該檢測可以使用尿液作為標本進行檢測，實現無創取樣，改變目前UU檢測大多用泌尿生殖道拭子標本的現狀，優化了取樣流程。

在初檢結果中，與UU培養結果作比較，UU-SAT拭子標本的檢測靈敏度為97.1%(170/175)，特異度為97.8%(271/277)，差異無統計學意義(χ2=0.010 2，P=0.919 7)；UU-SAT尿液標本的檢測靈敏度為96.0%(168/175)，特異度為98.9%(274/277)，差異無統計學意義(χ2=0.163 5，P=0.686 0)。對于SAT檢測陽性而PCR法或培養法檢出陰性的情況，作者認為原因可能是：采集的試紙中病原菌含太少，培養靈敏性不足，也可能是患者正處于感染初期，病原體DNA量較少，RNA量相對較多，則以檢測RNA的SAT能檢測到病原體的存在。SAT法核酸提取過程中，反應抑制物少，可有效減少假陰性，提高檢測靈敏度[4-5]；對于SAT檢測陰性而PCR法或培養法檢出陽性的情況，可能是標本保存不當引起檢測的RNA丟失；尿液中存在著抑制核酸擴增的物質或者UU特異度序列突變；也很可能是操作過程中受到RNase的作用使得RNA降解，因此實驗過程中必須使用專用加樣器，離心管、洗頭等一次性耗材實驗前必須全部高壓滅菌。但正是RNA容易降解的特點，使得SAT實驗后擴增的RNA能迅速降解，大大降低了PCR實驗室內交叉污染引起的假陽性問題[6]。近年來研究認為，PCR法雖然有較高的靈敏度和特異度，但不能區分所檢測的DNA是來自活菌還是死菌，患者治療后病菌死亡，但病菌DNA仍在體內繼續存在一段時間，PCR檢測陽性，容易導致過度治療[7-11]。本文復查175例UU培養陰性患者中仍有8例PCR檢測顯示陽性，作者認為可能和上述原因有關，因而PCR法在判斷愈后方面有所不足。此外，對175例UU-培養陽性患者進行臨床規范治療后再次采集標本，按原方法進行復檢，與UU培養結果作比較，UU-SAT拭子標本的檢測靈敏度為97.8%(44/45)，特異度為99.2%(129/130)；UU-SAT尿液標本的檢測靈敏度為93.3%(42/45)，特異度為98.5%(128/130)；在復查時發現，雖然經過了規范的治療但仍有45例患者標本檢測結果陽性，作者認為這可能和患者對藥物治療的個體差異、耐藥性或針對特殊人群的治療方案有關，具體原因有待探討。

需要強調的是，現在認為UU也是正常人泌尿生殖道中寄居的微生物之一，UU檢測陽性并不完全表示泌尿生殖感染，只提示泌尿生殖道UU的存在，診斷還需與患者的臨床癥狀相結合。

綜上所述，實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術作為新一代的核酸檢測技術在臨床實驗室生殖道UU檢測中，既具備了PCR的高靈敏度和高特異度，又具有很好的判斷預后效果，同時又可采用尿液作為檢測標本，方便患者及醫務人員，適合臨床實驗室泌尿生殖道患者UU的檢測，是值得推廣的一種檢測方法。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.045

A

1673-4130(2016)23-3348-03

2016-06-15

2016-09-05)

△通訊作者，E-mail:95235205@qq.com。