PCR結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于肺炎支原體感染檢驗(yàn)價(jià)值評(píng)價(jià)

顧秀玉

(江蘇省蘇州市立醫(yī)院北區(qū)檢驗(yàn)科 215008)

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·臨床研究·

PCR結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于肺炎支原體感染檢驗(yàn)價(jià)值評(píng)價(jià)

顧秀玉

(江蘇省蘇州市立醫(yī)院北區(qū)檢驗(yàn)科 215008)

目的 研究分析聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用于肺炎支原體(MP)感染檢驗(yàn)的價(jià)值。方法 本次研究行回顧性調(diào)查法，采集126份MP標(biāo)本，分別采用PCR和ELISA對(duì)每個(gè)標(biāo)本的MP進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比記錄各組標(biāo)本的檢出陽(yáng)性率，分析兩種方法結(jié)合使用進(jìn)行檢驗(yàn)的效果。結(jié)果 對(duì)于MP的檢驗(yàn)，ELISA與PCR的陽(yáng)性檢出率分別82.5%、81.0%，陰性檢出率分別為17.5%、19.0%，兩組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組結(jié)合使用的陰、陽(yáng)性檢出率分別為25.6%，99.3%。結(jié)論 對(duì)于MP檢測(cè)而言，PCR與ELISA對(duì)其的敏感性與特異性均較理想，兩者聯(lián)合可提高陽(yáng)性檢出率，有利于支原體肺炎疾病的早期診斷與治療。

聚合酶鏈反應(yīng)； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)； 肺炎支原體； 聯(lián)合應(yīng)用

近年來，肺炎支原體(MP)感染率有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，尤其在兒童中的感染率[1]。MP的傳播途徑主要為呼吸道，可引發(fā)多種呼吸道疾病，甚至引起全身機(jī)體的損害。患者感染MP可出現(xiàn)支原體肺炎的癥狀，也可出現(xiàn)上呼吸道感染的癥狀，如支氣管炎、氣管炎、咽炎等。MP的感染與發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等疾病相關(guān)，并可間接引發(fā)腎炎性腎病、急性腎炎等，患者可并發(fā)出現(xiàn)心包炎、心肌炎、心功能衰竭。因此，臨床上需對(duì)MP患者盡早進(jìn)行檢查確診，但目前尚無公認(rèn)的快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法[2]。本文圍繞PCR結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用于MP感染檢驗(yàn)的價(jià)值展開討論，取得了較為滿意的結(jié)果，現(xiàn)具體結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2015年1～12月本院收治的126例MP感染患者為對(duì)象實(shí)施研究方案。患者年齡4個(gè)月至13歲，平均(7.2±2.6)歲。臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱咳嗽，用磺胺類或β內(nèi)酰胺類藥物治療無效，使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物后表現(xiàn)為有效，符合MP感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。并同時(shí)采集126例普通細(xì)菌性肺炎標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)X線片結(jié)果顯示存在間質(zhì)改變或片狀浸潤(rùn)性陰影，或伴有出現(xiàn)胸腔積液；(2)支原體抗體的效價(jià)在急性期與恢復(fù)期以4倍及以上上升。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 標(biāo)本均在患者入院當(dāng)天采集，采集方法為靜脈取血，并立即對(duì)血清進(jìn)行分離。具體采集方法如下：選用支氣管肺泡灌洗液法(BALF)，纖支鏡型號(hào)為Olympus-P30，在麻醉與術(shù)前準(zhǔn)備工作完成后，清除患者段支氣管處的開口處痰液、分泌物、局麻所用藥物。隨后，在目標(biāo)支氣管開口將纖支鏡嵌入，若目標(biāo)支氣管已完全阻塞，則將纖支鏡改為向目標(biāo)支氣管的上方嵌入或?qū)χ繕?biāo)支氣管的開口處進(jìn)行沖洗。在灌洗瓶的端口接上負(fù)壓吸引器與纖支鏡，隨后中斷負(fù)壓，并叮囑患者降低呼吸幅度，在活檢孔中注入20 mL的生理鹽水(其溫度與人體正常體溫相同)，當(dāng)即開始負(fù)壓吸引。將纖支鏡上提合適的角度，使液體可以順利回收，重復(fù)3次。將回收所得的BALF保存于無菌器皿中，本研究標(biāo)本的平均回收率為46.2%(41%～64%)。最后將BALF進(jìn)行離心操作，取上清液并置于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存。

1.3.2 ELISA 對(duì)標(biāo)本血清內(nèi)的MP-IgM進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒產(chǎn)自深圳安群生物技術(shù)專業(yè)公司，所有操作均按說明書實(shí)施。具體操作步驟如下：所用反應(yīng)板被單克隆MP抗原包裹，隨后在其中置入待測(cè)標(biāo)本，并同時(shí)置入MP抗原。若待測(cè)標(biāo)本中含有MP抗體，會(huì)與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，出現(xiàn)顯色反應(yīng)，反之，則無明顯變化。

1.3.3 PCR 所用全自動(dòng)的PCR分析儀產(chǎn)自Perkin Elmer(型號(hào)為PE 5700)，試劑盒產(chǎn)自達(dá)安基因股份有限公司。將DNA模板、PCR mix、TAQ以一定比例混合。預(yù)反應(yīng)在93 ℃的溫度下反應(yīng)2 min，再在93 ℃、45 s，55 ℃、55 s范圍下循環(huán)各10次，最后在93 ℃、30 s，55 ℃、45 s范圍下循環(huán)各30次。根據(jù)PCR過程中釋放的熒光反映產(chǎn)物劑量，將熒光轉(zhuǎn)化為DNA模板劑量，并判斷結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果 對(duì)于MP的檢驗(yàn)，ELISA與PCR的陽(yáng)性檢出率分別82.5%、81.0%，陰性檢出率分別為17.5%、19.0%，兩組結(jié)合使用的陰、陽(yáng)性檢出率分別為25.6%，99.3%。兩組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但與非MP感染的結(jié)果比較，兩種方法檢出率均具有明顯優(yōu)勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.2 兩種方法敏感性與特異性對(duì)比 兩種方法在敏感性與特異性對(duì)比上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是兩種方法聯(lián)合使用的差異較單獨(dú)利用一種方法的檢測(cè)效果更為明顯。因此，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩種方法敏感性與特異性對(duì)比(%)

3 討 論

支原體是目前發(fā)現(xiàn)的存在于細(xì)胞外的最小微生物，可從人體中分離5種致病性的支原體[4]。MP即原發(fā)性非典型肺炎，可發(fā)生于全年，尤其在冬季的發(fā)病率最高，或可產(chǎn)生流行性發(fā)病。其傳播途徑主要為呼吸道傳播，且在人體內(nèi)的潛伏可達(dá)14～21 d，潛伏期較長(zhǎng)[5]。其常見的檢測(cè)方法有間接血凝試驗(yàn)、冷凝集試驗(yàn)、被動(dòng)凝集法、ELISA等，即MP的分離與培養(yǎng)、PCR、血清學(xué)檢查。MP的分離培養(yǎng)檢測(cè)法是最為理想的方法，所提供的確診依據(jù)最為可靠，但由于臨床所采集的標(biāo)本病原體含量較少、其他雜菌數(shù)量較多、陽(yáng)性率低、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)無法得以普及。而血清學(xué)檢查中的ELISA是最為常見的檢測(cè)方法。當(dāng)患者感染MP時(shí)，體內(nèi)最早出現(xiàn)的抗體為抗MP-IgM抗體，在感染后7 d即可測(cè)出，于10～30 d數(shù)量最多，在12～16周逐漸消失[6-8]。因此，抗MP-IgM抗體是臨床上早期診斷MP感染的有力依據(jù)。而PCR是基于模板DNA理論進(jìn)行定量檢測(cè)，其主要作用原理為測(cè)定目標(biāo)的核酸劑量來間接反映菌數(shù)，突出優(yōu)點(diǎn)為大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并可降低模板間的稀釋濃度來提高準(zhǔn)確性。但傳統(tǒng)PCR的敏感性與特異性欠佳，因此本研究采用的肺泡來源于目標(biāo)器官即病灶處的肺泡，從而可降提高陽(yáng)性檢出率。

本文研究結(jié)果顯示，ELISA對(duì)MP-IgM抗體的敏感性與特異性均較高，分別為82.5%、17.5%。兩種方法聯(lián)合使用進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)敏感性達(dá)到99%以上，特異性為25%以上。但其結(jié)果會(huì)受較因素干擾，如抗體的峰值出現(xiàn)較晚等。因此，單份血清所得結(jié)果可靠性較低，需增加標(biāo)本數(shù)量。同時(shí)，重癥患者體內(nèi)不存在特異性抗體，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果失效。因此，單純使用ELISA進(jìn)行檢測(cè)會(huì)使結(jié)果存在假陰性與假陽(yáng)性。而PCR結(jié)果顯示敏感性與特異性分別為81.0%、19.0%，與ELISA差別不大，說明兩者結(jié)合使用可提高陽(yáng)性檢出率。但是兩種方法聯(lián)合使用的差異較單獨(dú)利用一種方法的檢測(cè)效果更為明顯。因此，存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，對(duì)于MP檢測(cè)而言，PCR與ELISA對(duì)其的敏感性與特異性均較理想，兩者聯(lián)合可提高陽(yáng)性檢出率，有利于支原體肺炎疾病的早期診斷與治療。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.054

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1673-4130(2016)23-3364-02

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