酶解南瓜汁發酵酒加工條件及其活性成分變化

苑建偉，侯小歌，田豐收，李勝婷，王克廣

（1.周口職業技術學院，河南周口466000；2.周口師范學院生命科學與農學學院，河南周口466000；3.扶溝縣雅濱生物工程有限公司，河南周口461300）

酶解南瓜汁發酵酒加工條件及其活性成分變化

苑建偉1，侯小歌2，*，田豐收2，李勝婷2，王克廣3

（1.周口職業技術學院，河南周口466000；2.周口師范學院生命科學與農學學院，河南周口466000；3.扶溝縣雅濱生物工程有限公司，河南周口461300）

以蜜本南瓜為原料釀造南瓜酒。采用單因素和正交試驗法優化提高南瓜出汁率的酶解條件，最適南瓜酒發酵條件下研究南瓜多糖變化規律。結果表明：果膠酶和糖化酶處理對南瓜出汁率影響差異性顯著（P<0.05），當果膠酶添加量0.25%、50℃作用2.0 h和糖化酶添加量0.5%、55℃作用2.0 h時，南瓜出汁率可提高到30%以上；南瓜酒在最適發酵條件下即酵母接種量0.3%、24℃發酵7 d，酒精度高于8.5%，多糖含量穩定在1.10%左右。

南瓜酒；酶解；出汁率；發酵條件；多糖

蜜本南瓜為雜交南瓜種，在我國種植面積廣，產量高，組織細膩，口味甘甜，且富含碳水化合物、蛋白質、維生素、礦物質、微量元素及活性成分[1]，具有降血糖、抗高血壓、預防心血管疾病等功效[2-3]，是南瓜栽培品種中最適合食用和深加工的品種之一。近年來，南瓜以其獨特的營養價值和藥用價值深受世人青睞，隨之也引起了相關研究學者對南瓜功能因子、活性成分、功能性食品的開發等領域的廣泛關注[4-6]。南瓜酒則是南瓜深加工的功能性食品之一。有研究表明：南瓜酒與南瓜提取液相比具有明顯的清除自由基功效，且主要抗氧化活性成分表現為維生素C、多酚和多糖[7]，因此，開發南瓜酒尤其是活性成分較高的南瓜酒具有重要的食品工業應用價值。目前，對于南瓜酒的研究已有出現，且大多研究主要集中在發酵工藝或發酵條件方面，但采用酶解法優化南瓜出汁率和發酵液還原糖含量的工藝條件，并考察南瓜酒發酵過程中典型活性成分-多糖的變化規律的研究少見報道。由于成熟的南瓜中含有豐富的果膠和淀粉，因此本研究以含糖量高且普遍種植的蜜本南瓜為原料，采用酶解法提高南瓜漿的出汁率和含糖量，并對酒精發酵工藝條件進行研究，同時探索南瓜酒在釀造過程中活性成分—多糖的變化規律，以期為開發低成本高價值的保健型南瓜酒提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟的蜜本南瓜（購自周口市川匯區農貿市場），蒽酮試劑，檸檬酸（食品級），釀酒高活性干酵母（安琪釀酒酵母），果膠酶（食品級，3萬U/g），糖化酶（食品級，5萬U/g）。

1.2 主要儀器與設備

AL204電子天平：上海梅特勒托力多儀器有限公司；UV5200紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋、LRH系列生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；BCD-215KCM海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；JJ2-組織搗碎機：金壇市杰瑞爾電器有限公司；H1850R高速冷凍離心機：湖南湘儀；調溫電熱套：上海儀器儀表有限公司。

1.3 南瓜酒的釀造工藝流程及操作要點

工藝流程：南瓜→清洗→切半軟化→打漿→果膠酶處理→糖化酶處理→過濾→殺菌→前發酵（接種活性干酵母）→后發酵→過濾→配兌→成品。

操作要點：成熟南瓜沖洗切片，蒸煮軟化，原料與水比例為1∶1（g/g）打漿，并添加0.2%（質量分數）的檸檬酸護色，按試驗設計添加果膠酶和糖化酶處理南瓜漿（方案見1.4試驗設計中的1.4.1和1.4.2），過濾除渣制得南瓜汁，殺菌后添加SO2，接種活化干酵母進行酒精發酵，主發酵工藝優化按實驗設計（見1.4試驗設計中的1.4.3）進行，后發酵結束進行過濾調配殺菌即可得到南瓜酒。

1.4 試驗設計

1.4.1 果膠酶處理試驗

采用單因素和正交試驗進行酶解條件優化，以出汁率為測定指標。設計果膠酶添加量為0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%（質量分數），作用溫度為40、45、50、55、60℃，作用時間為，pH為4.5，處理時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。單因素試驗基礎上，設計酶用量、酶解溫度、酶解時間三因素三水平正交試驗（見表1）。

1.4.2 糖化酶處理試驗

在最優果膠酶工藝條件基礎上，以出汁率、還原糖含量為指標，設計糖化酶處理的三因素三水平正交優化試驗（試驗方案見表3）。糖化酶添加量為0.2%、0.3%、0.4%（質量分數），溫度為50、55、60℃，作用時間為1.0、1.5、2.0 h，pH為4.0。

1.4.3 酶解南瓜汁發酵工藝條件試驗

酵母接種量、發酵溫度和發酵時間為影響因素，酒精度為測定指標，選擇活化釀酒活性干酵母菌懸液接種量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%（體積分數），發酵溫度為16、18、20、24、28℃，發酵時間為3、5、7、9、11 d，以酒精度為指標考察以上三因素對南瓜酒發酵質量的影響，確定酶解南瓜汁制取南瓜酒最適發酵條件。

1.4.4 南瓜酒活性成分變化測定

在最佳南瓜酒的加工工藝條件下，測定南瓜原料、南瓜漿、南瓜汁及其發酵3、5、7、9、11 d時的多糖含量，探索南瓜多糖在釀造酒過程中的變化規律，以便更好控制保健型南瓜酒的發酵進程。

1.4.5 主要指標的測定

出汁率（%，質量分數）：稱重法[8]；還原糖含量（%，質量分數）：DNS比色法[9]；酒精度：蒸餾酒精計法[10]；多糖含量（%，質量分數）：采用苯酚-硫酸比色法[11]。

1.4.6 數據處理與分析

每個試驗樣做3次平行，取其平均值，采用SPSS 16.0軟件和正交助手Ⅱv3.1處理試驗數據并對結果進行顯著性方差分析。

2 結果與分析

2.1 果膠酶處理南瓜漿的試驗結果

果膠酶處理南瓜漿的單因素試驗結果如圖1所示。

圖1 果膠酶單因素試驗對南瓜漿出汁率的影響Fig.1 Effectof single factor testby pectinaseon pum pkin juice rate

隨著果膠酶用量的增加，南瓜漿出汁率呈現先升高后降低的趨勢，果膠酶添加量為0.35%時，出汁率達到最大值為22.63%（圖1a）。南瓜漿的出汁率隨果膠酶作用溫度的升高先上升后降低，50℃時出汁率達到最大值21.05%，50℃到55℃時，出汁率緩慢下降，60℃后出汁率明顯降低（圖1b），原因是高溫抑制果膠酶的活性，導致南瓜漿中果膠物質降解緩慢從而影響了出汁率。圖1c顯示果膠酶作用1 h后，出汁率迅速升高，2 h時出汁率達到最大值，此后隨著作用時間的延長出汁率呈下降趨勢。分別對果膠酶添加量、作用溫度、作用時間3個因素的試驗數據進行方差分析，果膠酶的3種處理對出汁率的影響均為顯著（P<0.05），故選擇果膠酶添加量0.35%、溫度50℃、時間2 h水平進行正交優化試驗，其結果見表1。

表1 正交優化試驗結果Table1 The resultsof orthogonal test

續表1 正交優化試驗結果Continue table1 The resultsof orthogonal test

對果膠酶酶解南瓜漿的試驗結果進行極差分析（表1）和方差分析（表2）可知：果膠酶處理南瓜漿影響出汁率，提高南瓜漿出汁率的最優水平組合為A1B2C2，即果膠酶添加量為0.25%，酶解溫度為50℃，酶解時間2.0 h，該條件下，南瓜出汁率高達27.48%；影響出汁率各因素的主次順序為B>A>C，即酶解溫度為主要影響因素；酶解溫度對南瓜漿出汁率影響顯著（P< 0.05），酶的添加量和作用時間對出汁率影響不顯著（P>0.05）。

表2 果膠酶作用正交試驗的方差分析Table2 Analysisof varianceof theorthogonal testby pectinase enzym e training

2.2 糖化酶處理南瓜漿的試驗結果

盡管南瓜含糖量較高，但還含有5%左右的淀粉[12]，為提高南瓜酒的出酒率，可適量添加糖化酶處理南瓜漿，促使更多糖轉化為可發酵的還原性糖。本試驗最優果膠酶處理南瓜漿的工藝基礎上，添加糖化酶處理南瓜漿，其正交優化試驗結果如表3所示。

表3 糖化酶作用的正交試驗結果Table3 The resultsof orthogonal testby saccharifying enzym e

續表3 糖化酶作用的正交試驗結果Continue table3 The resultsof orthogonal testby saccharifying enzyme

對表3的試驗結果進行方差分析（見表4）。

表4 糖化酶作用正交試驗的方差分析Table4 Analysisof varianceof orthogonal testby saccharifying enzym e training

糖化酶處理南瓜漿能影響其出汁率和還原糖的含量。糖化酶的添加量、酶解溫度對南瓜漿的出汁率影響顯著（P<0.05），糖化酶的作用時間對出汁率影響不顯著。級差值顯示影響出汁率的糖化酶處理南瓜漿的最優水平組合為A2B2C3，即酶添加量為0.5%，酶解溫度為55℃，酶解時間為2.0 h，該條件下出汁率可高達30.17%。糖化酶的添加量對南瓜汁還原糖含量影響顯著（P<0.05），糖化酶作用溫度和時間對還原糖含量影響不顯著（P>0.05），該結果與糖化酶影響出汁率的結果基本一致，原因可能是糖化酶在最優條件下作用南瓜漿，使大分子的糖類轉化為可溶性的還原糖，導致南瓜漿還原糖含量升高，黏度降低，從而出汁率也升高。

2.3 酶解南瓜汁酒的發酵條件選擇

酶解南瓜汁發酵酒發酵條件試驗結果見圖2。

圖2 南瓜酒發酵條件試驗結果Fig.2 The resultsof ferm enting conditionsof pumpkin w ine

由圖2a可知，酒精含量隨酵母接種量的增加先增加后降低，接種量為0.3%時，酒精含量最高達9.13%，之后隨著接種量的增加，酒精含量反而下降，原因一方面是接種量過大導致菌體提前衰老而降低發酵速率，另一方面是酵母消耗更多碳源成為其自身細胞成分，從而降低了出酒率[13-14]，故選擇酵母最佳接種量為0.3%。選擇最佳接種量為0.3%，設計不同發酵溫度，考察溫度對南瓜酒酒精度的影響（圖2b顯示），當溫度為16℃時酒精度最低，說明溫度偏低不利于果酒酵母菌進行乙醇代謝，當溫度升至24℃時，酵母菌代謝最為旺盛，酒精度最高達到8.69%，隨后溫度再上升酒度反而下降，表明高溫抑制果酒酵母的酒精發酵，因此南瓜酒發酵溫度不能超過30℃[2]，最佳發酵溫度為24℃。選擇接種量為0.3%，溫度為24℃的最佳發酵條件下，考察發酵時間對南瓜酒酒精度的影響，圖2c說明隨著南瓜酒發酵時間的延長，酒度先上升后下降，最適宜的發酵時間為7 d。

綜上結果可知：酶解南瓜汁發酵酒的酒精度受酵母接種量、發酵溫度和發酵時間的影響。選擇單因素試驗的最佳條件即接種量為0.3%，發酵溫度為24℃，發酵7 d，可獲得酒精度不低于8.5%的南瓜酒。

2.4 南瓜酒多糖變化規律研究

在最佳發酵條件下，測定南瓜酒發酵過程即從原料、南瓜漿、酶解南瓜汁到發酵3 d～11d南瓜酒中多糖含量，以期為南瓜酒發酵過程控制提供依據。南瓜酒發酵過程多糖含量變化見圖3。

圖3 南瓜酒發酵過程中多糖含量的變化Fig.3 Chang of Polysaccharide content in pumpkin wineduring fermenting

由圖3可知，南瓜汁中多糖含量較原料和南瓜漿中的高，最高達到6.46%。用熱水浸提法提取南瓜原料中的多糖，使未經處理的南瓜多糖溶解于水中，此時多糖含量較高；南瓜經蒸煮打漿后可能部分多糖融入沸水中導致含量有所下降；南瓜漿經過果膠酶和糖化酶處理，促使原料中的淀粉轉化為多糖，且南瓜細胞中的大部分多糖融入南瓜汁中，因此南瓜汁中多糖含量相對較高；南瓜汁發酵初期，酵母利用南瓜多糖轉化酒精的能力較強，因此其含量急劇下降，經過發酵，使部分的還原糖被酵母利用代謝為酒精，導致多糖含量急劇下降，隨著發酵時間的延長，南瓜多糖含量下降趨勢緩慢，當發酵至7 d和11 d時，多糖含量無明顯變化，基本穩定在1.10%左右，原因是發酵9 d～11 d時酵母作用幾乎停止，多糖含量得以相對穩定。

3 結論與討論

1）pH 4.5條件下，南瓜漿中添加果膠酶0.25%，50℃酶解2.0 h，出汁率提高到27.48%，然后南瓜漿的pH調至4.0后，添加0.5%的糖化酶，55℃酶解2.0 h，出汁率達30.17%，提高了2.69%，該條件下還原糖含量提高到28.91%。酶解南瓜汁發酵南瓜酒的發酵條件為酵母接種量0.3%，發酵溫度為24℃，發酵時間7 d，該工藝條件下，南瓜酒酒精度達8.0%以上，多糖含量為1.31%，獲得制品為淺橙黃色，色澤均一，有南瓜香氣，酒味濃郁，無異味，口感適宜。

2）在南瓜酒釀造過程中，活性成分-多糖含量呈現先升高再急劇下降最后趨近穩定的變化規律。從原料、南瓜漿、酶解南瓜汁到發酵3 d～11 d南瓜酒中多糖含量中，南瓜汁中多糖含量最高，達到6.46%，南瓜酒發酵至7 d和11 d時，多糖含量基本穩定在1.10%左右。

3）在南瓜酒的釀造過程中，南瓜汁中的多糖含量高達6.46%，發酵初期，多糖含量急劇下降，轉化為南瓜酒中的有效成分酒精，但在發酵中后期，多糖含量基本穩定，保留了南瓜中的活性成分。多糖作為保健型食品的功能因子，具有廣闊的市場前景，南瓜酒發酵結束后多糖含量仍大于1%，說明南瓜酒對于南瓜新型保健產品開發具有一定意義。

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The Process Conditions of the Pum pkin W ine Fermented by Pum pkin Juic Obtained by Enzyme Hydrolysis and Changing Rule of the Active Ingredients during Ferm enting

YUAN Jian-wei1，HOUXiao-ge2，*，TIANFeng-shou2，LISheng-ting2，WANGKe-guang3
（1.Zhoukou Vocational TechnicalCollege，Zhoukou 466000，Henan，China；2.Collegeof Life Science and Agriculture，Zhoukou NormalUniversity，Zhoukou 466000，Henan，China；3.Fugou Biological Engineering Co.Ltd.，Zhoukou 461300，Henan，China）

The ripe and honey pumpkinwasused as thematerial to brew pumpkin wine.Based on single factor and orthogonal design experiments were applied to optimize enzyme hydrolysis conditions of improving juice yield，and the changing rule ofpolysaccharide content in pumpkinwine fermented under the optimal conditions was studied during brewing.The results showed that the pectinase enzyme and saccharifying enzyme respectively training pumpkin pulp had significanteffecton juice yield（P<0.05），the pumpkin juice rate could reach above 30%under the optimal enzyme hydrolysis conditions of adding 0.25%pectinase enzyme，50℃hydrolyzing 2.0 h and adding 0.5%saccharifying enzyme，55℃hydrolyzing 2.0 h.The suitable fermenting parameterswere yeast inoculum 0.3%，24℃fermenting 7 d.Under these conditions，the alcohol content in the pumpkinwineobtainedwasabove8.5%，polysaccharide contentwassteady at1.10%.

pumpkinwine；enzyme hydrolysis；pumpkin juice rate；fermenting conditions；polysaccharide

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.022

2016-03-13

河南省教育廳科學技術研究重點項目（14A180026）；河南省高等學校重點科研項目（15A150087）

苑建偉（1977—），男（漢），講師，碩士，研究方向：糧油食品加工。

*通信作者：侯小歌（1977—），女，副教授，研究方向：發酵工程。