基于形態和分子系統學對荒漠生羊肚菌的鑒定

趙振西，楊梅，王國慶，夏占峰，徐彪 *

（1塔里木大學生命科學與技術學院/塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

（2阿克蘇地區林業發展保障中心，新疆 阿克蘇 843006）

（3托木爾峰國家級自然保護區管理局，新疆 阿克蘇 843006）

（4仲愷農業工程學院植物健康創新研究院，廣東 廣州 510225）

羊肚菌（Morchella），隸屬子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellasceae）。因菌蓋多為不規則且呈蜂窩狀，形態酷似羊肚，故稱羊肚菌［1］。其肉質脆嫩可口，風味獨特，富含大量人體必需氨基酸、多種維生素和礦質元素，是一種世界公認的珍貴、稀有食用菌［2］。在歐洲，羊肚菌被認為是僅次于塊菌的美味食用菌；北美人則將其作為食用菌中的佳品；在我國除作為食用菌品種外，《本草綱目》中曾有記載“甘寒無毒，益腸胃，化痰利氣”的藥用功效［3］。其食藥用價值在國內外備受追捧，市場需求量日益增加。近年來，雖然人工栽培羊肚菌的技術得到突破，市場前景被業內廣泛關注，然而，人工栽培產量不穩定是當前制約羊肚菌產業發展的重要瓶頸［4-5］。如何科學開發、利用和保護野生資源，尋找優良易于栽培的品種，是一個亟待解決的問題。

新疆地處我國西北干旱區，分布著大量獨特的生物資源，已經報道的野生羊肚菌有：黑脈羊肚菌（M.angusticeps）、高羊肚菌(M.elata)、小羊肚菌（M.deliciosa）、尖頂羊肚菌（M.conica）、粗柄羊肚菌(M.crassipes)、羊肚菌(M.esculenta)、半開羊肚菌(M.semilibera)等［6-9］，大多分布在烏魯木齊、伊犁、石河子、阿勒泰等北疆林帶中［10-15］。然而，南疆地區作為新疆主要地區之一，其野生羊肚菌資源的種類、數量以及生境的調查研究卻很少。

2018年4—5月期間，在新疆阿拉爾地區部分荒漠果園中發現野生羊肚菌，其分布于荒漠生境較為罕見。為明確該物種的分類地位，本研究通過形態學特征觀測，聯合ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α基因序列分析，對采自新疆南疆荒漠地區野生羊肚菌進行鑒定，以明確該物種的分類地位和生態分布，為開發利用本地資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試野生羊肚菌于2018年4—5月采集于新疆阿拉爾荒漠蘋果園（81°17′19″E，40°32′46″N），憑證標本保藏于塔里木大學菌物標本館（HMUT 7691，HMUT 7692）。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態觀測

對荒漠果園野生羊肚菌進行現場拍照，觀察、記錄并測量新鮮子實體具有分類價值的結構［16］。用3%的KOH溶液作為浮載劑，對干燥標本進行徒手切片［17］，使用顯微鏡（Nikon ni-E，Nikon，Japan）觀測其微觀形態特征（包括子囊、孢子等）。

1.2.2 DNA的提取

用無菌刀片切取約50～100 mg子實體的內部組織，置于滅菌的1.5 mL離心管，加入2～3粒3.5 mm大的無菌鋼珠，經MP Fastprep-24樣本制備系統（MP Biomedicals，USA）組織粉碎，采用E.Z.N.A.TM Fungal Mini Kit試劑盒（OMEGA Biotek，USA），按照試劑盒操作說明提取DNA，基因組DNA經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，置-20℃的冰箱內保存備用。

1.2.3 PCR擴增及檢測

PCR擴增采用25 μL體系，其中2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各 1 μL（10 μmol/L），DNA 模板1 μL，用ddH2O補齊。5個標記基因序列擴增引物（如表1所示）。ITS序列PCR擴增反應程序為：95℃預變性3 min；94℃變性40 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。LSU序列PCR擴增反應程序為：94℃預變性1 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min［18］。rpb1、rpb2和ef1-α序列的PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性1 min，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min［19］。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶送往上海生物工程有限公司進行正反向測序。

表1 PCR和擴增引物

1.2.4 系統發育分析

供試樣本測序獲得的序列，使用Seqman v.7.l.0軟件分別進行拼接和校準后提交至GeneBank，并在NCBI中進行Blast比對分析選用序列（如表2所示）；以變紅羊肚菌（Morchella rufobrunnea）為構建系統發育樹的外群；使用MAFFT v.7.47進行多序列比對，經PhyloSuite.v.1.1.14軟件進行聯排，獲得5個基因的聯合矩陣；聯合矩陣提交至CIPRES在線服務平臺（https://www.phylo.org），經Mrmodeltest 2.3［23］選擇最佳模型，使用 RAxML-HPC2 on XSEDE（8.2.12）［24］和MrBayes on XSEDE（3.2.7a）［25］分別構建系統發育樹。系統發育樹使用FigTree 1.4.3查看編輯。

表2 本研究中的參考樣本及5個基因的登錄號

續表2

2 結果與分析

2.1 分子系統發育分析

供試樣本經測序，所得基因序列長度分別為ITS：1 036 bp，LSU：1 023 bp，rpb1：757 bp，rpb2：725 bp，ef1-α：1 013 bp（如圖1所示）。基于 ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α聯合矩陣，采用最大似然法和貝葉斯法構建的系統發育樹，其拓撲學結構一致（如圖2所示），供試樣本屬黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade），與泛美羊肚菌（Morchella americana）聚為同一支，支持率為97%/1.00（ML/BI）。

圖1 泛美羊肚菌(Morchella americana)基因組DNA ITSLSU-rpb1-rpb2-ef1-α序列擴增結果

圖2 基于ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α聯合矩陣采用最大似然法和貝葉斯法構建的系統發育樹

2.2 形態描述

子實體中等，菌蓋長4～8 cm，寬3～6.5 cm，常見卵圓形至近球形，頂端凸出或呈鈍錐形，偶見近圓形，表面多凹坑，且不規則，灰棕色至棕黃色。菌柄長5～10 cm，寬2～5 cm，常見棍棒狀或近棍棒狀，白色至淡黃色，表面分布白色或淡黃色顆粒，中空，基部膨大，并有顯著的粗凸隆起（如圖3A、3B所示）。子囊孢子橢圓形，表面光滑，透明，無油滴；子囊圓柱形，透明，常見8個孢子（如圖3C、3D所示）。

圖3 供試樣本形態觀察

3 討論

Morchella americana是世界分布較為廣泛的種［26-27］，由于分類標準的不統一，同一物種在不同地區常賦予不同名稱，同物異名現象普遍。在北美，KUO M等［28］曾以M.esculentoides對其報道；在歐洲，CLOWEZ P 等［29］以 M.rigida進行描述，而KELLNER 等［30］則將其記載為 M.esculenta；基于LSU、rpb1、rpb2和ef1-α這4個基因的核苷酸序列，O’DONNELL K等［31］利用多基因譜系一致性系統發育學物種識別法（GCPSR），將羊肚菌屬劃分為黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）和變紅羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade），并采用了類群縮寫+數字的方法來命名Esculenta支系（如Mes-n）和Elata支系（如Mel-n）。DU X H等［27,32］對中國各地區采集的M.esculenta和M.esculentoides樣本進行研究并對其物種名稱進行了規范。本研究綜合形態特征和多基因系統發育分析，明確分布于荒漠生境中的野生羊肚菌與O’DONNELL P等［31］報道的系統發育種Mes-4一致，但子實體較其偏小，菌蓋近球形居多，成熟時顏色呈黃色或淺灰色，有時菌蓋邊緣出現淺紅色至紅棕色；菌柄基部膨大，且脊凸起顯著。

目前，已記載M.americana的生境主要分布于榆樹林、楊樹林、河岸旁或林地火燒地中，偶有發生在針葉林內［28-30,32］，而分布于荒漠生境則未見報道。M.americana在荒漠生境中分布，進一步表明該種的生態適應性強或可能是長期適應性進化的結果。利用該種在特殊生境的適應性，可為開發利用本地野生羊肚菌資源進行人工栽培提供重要的指導。