mTORC1 信號促進前成骨細胞MC3T3-E1的分化成熟①

張婧婧 張 楠 吳 偉 王 鵬 楊景瑞 段巨洪 于海川

(河南省新鄉醫學院醫學檢驗學院和分子診斷與醫學檢驗技術河南省協同創新中心，新鄉453003)

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mTORC1 信號促進前成骨細胞MC3T3-E1的分化成熟①

張婧婧 張 楠②吳 偉③王 鵬③楊景瑞 段巨洪 于海川

(河南省新鄉醫學院醫學檢驗學院和分子診斷與醫學檢驗技術河南省協同創新中心，新鄉453003)

目的：研究mTORC1 信號對前成骨細胞MC3T3-E1向成骨細胞分化成熟的調控作用。方法：通過向MC3T3-E1轉染pcDNA3.1-Raptor，對mTORC1 信號相關蛋白Raptor進行過表達。向MC3T3-E1轉染Raptor siRNA，對mTORC1 信號蛋白Raptor進行基因沉默。通過Real-time PCR方法測定Raptor的基因表達，通過蛋白免疫印跡法測定Raptor蛋白水平，并通過茜素紅染色檢測成骨礦化情況，以測定成骨分化程度。通過Real-time PCR檢測成骨分化指標的基因表達。結果：與對照組相比，Raptor過表達組的Raptor mRNA和蛋白水平明顯增加；茜素紅染色結果顯示Raptor過表達組染色更深，說明成骨礦化程度更高；熒光定量PCR結果顯示，Raptor過表達組的成骨分化標記基因以及成骨轉錄因子的表達量均高于對照組。與對照組相比，Raptor siRNA組的Raptor mRNA和蛋白水平明顯降低；茜素紅染色結果顯示Raptor siRNA組染色更淺，說明成骨礦化程度更低；熒光定量PCR結果顯示，Raptor siRNA組的成骨分化標記基因以及成骨轉錄因子的表達量均低于對照組。結論：mTORC1 信號促進前成骨細胞MC3T3-E1向成骨細胞分化成熟。

mTORC1信號；成骨分化；前成骨細胞

前成骨細胞是一種已經向成骨細胞方向進行定向的細胞類型[1]。前成骨細胞來源于多潛能間充質干細胞，并且可以在成骨相關信號的誘導刺激下進一步分化為成熟的成骨細胞[2]。因此，成骨分化的整個過程包括兩個階段，一是間充質干細胞被定向為前成骨細胞[3]，另一個過程是前成骨細胞進一步向成熟的成骨細胞分化[4,5]。這兩個分化過程都受到細胞外信號的緊密調控[6,7]。

mTOR信號通路是一種進化保守的，營養因子敏感性信號通路，并能在一系列細胞過程中起到重要的調控作用[8,9]。mTOR為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，并且在細胞內常以mTORC1或mTORC2兩種不同的復合物形式存在。這兩種復合物由不同的成分組成，例如mTORC1包含Raptor蛋白，而mTORC2包含Rictor蛋白[9]。當收到上游信號激活后，mTORC1和mTORC2控制不同的下游效應因子并影響不同的細胞過程[9,10]。已有基因敲除小鼠實驗證實，mTORC1在小鼠胚胎發育過程中的主要功能是對軟骨組織的大小進行調控[11]，而mTORC2主要功能在于促進骨質形成[12]。然而，通過使用mTOR信號抑制劑Rappamycin對mTOR信號進行研究，發現mTOR對成骨分化的調控既有促進效應也有抑制效應[13,14]。因此，mTOR信號在成骨分化過程中所扮演的具體角色至今尚未有定論。

考慮到成骨細胞分化的過程包含不同的兩個階段，我們推測mTOR信號對成骨分化的不同階段具有不同的效應。因此，本研究著重探索mTORC1對前成骨細胞MC3T3-E1向成熟的成骨細胞分化過程的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 MC3T3-E1細胞購自美國細胞庫ATCC。DMEM高糖培養基及胎牛血清(Gibco公司，美國)，青鏈霉素(碧云天公司，上海)，LB 培養基、RIPA裂解液和PMSF(苯甲基磺酰氟)(上海生工)，pcDNA3.1-Raptor通過基因克隆方法構建，TRIzol 總RNA抽提試劑(TaKaRa公司，日本)，Lipofectamie-2000(Invitrogen公司，美國)，二甲基亞砜(DMSO)、氨芐霉素、臺盼藍染液、HRP標記的二抗(Sigma公司，美國)，SYBRGreen PCR Master Mix(TOYOBO公司，日本)，BMP-2 (R&D公司，美國)，Anti-Raptor一抗(Abcam公司，英國)。siRNA由上海吉瑪生物技術公司定制。限制性內切酶BamHⅠ以及XhoⅠ、T4 DNA連接酶(NEB公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養以及誘導成骨分化 MC3T3-E1采用含10% FBS高糖DMEM培養基，在37℃、5% CO2及相對濕度條件下培養。采用終濃度為100 ng/ml 的BMP-2對MC3T3-E1進行為期7 d或14 d的成骨誘導分化。

1.2.2 RNA提取與熒光定量PCR 根據試劑盒提供的實驗方案使用TRIzol 總RNA抽提試劑進行總RNA提取。以總RNA為模板使用M-MLV反轉錄酶在25 μl體系中對cDNA進行反轉錄。用SYBR Green Ⅰ mix試劑進行熒光定量PCR實驗，使用ABI ⅦA7熒光定量PCR儀進行檢測。引物序列如表1所示，熒光定量PCR反應條件如下：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個循環；采用U6為內參。數據使用Ct值法(2-ΔΔCt)進行分析。

1.2.3 pcDNA3.1-Raptor質粒的構建 以MC3T3-E1基因組DNA為模板，用以下引物進行PCR擴增：上游序列AAGGATCCATGCATCGGGCAGTG-GACCC,以及下游序列TTCTCGAGTCATCGAGA-CGTGCTGGCGG。用限制性內切酶BamHⅠ以及XhoⅠ對質粒pcDNA3.1載體和PCR擴增條帶分別進行雙酶切，回收DNA條帶后用T4 DNA連接酶進行連接。轉化到DH5-α感受態細胞。挑選單克隆進行培養并抽取質粒DNA進行測序鑒定。

1.2.4 pcDNA3.1-Raptor以及Raptor siRNA轉染實驗 為實現Raptor過表達，實驗分組分為陰性對照組,BMP-2組，以及Raptor過表達組。陰性對照組以及BMP-2組均轉染pcDNA3.1空載體，過表達組轉染pcDNA3.1-Raptor質粒。為實現Raptor基因沉默，實驗分組分為陰性對照組,BMP-2組，以及Raptor siRNA組。陰性對照組以及BMP-2組均轉染非特異性siRNA陰性對照，過表達組轉染Raptor siRNA。質粒和siRNA均使用Lipofectamine? 2000試劑進行轉染。細胞培養基含10%胎牛血清，50 U/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素，轉染后，所有細胞在37℃溫度和5%CO2培養箱中進行孵育。

表1 Real-Time PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences for Real-Time PCR

GenePrimersequencesColⅠ5′?GAGCTGGTGTAATGGGTCCT?3′(Upstream)5′?GAGACCCAGGAAGACCTCTG?3′(Downstream)Ocn5′?AAGCAGGAGGGCAATAAGGT?3′(Upstream)5′?TTTGTAGGCGGTCTTCAAGC?3′(Downstream)Bsp5′?CAGGGAGGCAGTGACTCTTC?3′(Upstream)5′?AGTGTGGAAAGTGTGGCGTT?3′(Downstream)GAPDH5′?GACTTCAACAGCAACTCCCAC?3′(Upstream)5′?TCCACCACCCTGTTGCTGTA?3′(Downstream)Runx25′?GACTGTGGTTACCGTCATGGC?3′(Upstream)5′?ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA?3′(Downstream)Osx5′?GGAAAGGAGGCACAAAGAAGC?3′(Upstream)5′?CCCCTTAGGCACTAGGAGC?3′(Downstream)ATF45′?CCTGAACAGCGAAGTGTTGG?3′(Upstream)5′?TGGAGAACCCATGAGGTTTCAA?3′(Downstream)

1.2.5 免疫印跡實驗 將細胞用RIPA裂解液和PMSF(苯甲基磺酰氟)處理，冰上孵育30 min。4℃，12 000 r/min離心30 min，得上清蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。一抗anti-Raptor采用1∶1 000的比例進行使用,anti-GAPDH，HRP標記的二抗均以1∶2 000的比例進行使用。通過ECL法進行顯影。

2 結果

2.1 過表達Raptor的MT3T3-E1細胞構建成功 為了實現Raptor在MC3T3-E1細胞的過表達，我們首先構建了Raptor的基因表達質粒。通過以MC3T3-E1細胞的基因組DNA為PCR模板，我們對Raptor的編碼基因片段進行擴增。通過對PCR片段和表達載體pcDNA3.1進行限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，通過連接反應獲得pcDNA3.1-Raptor表達質粒。通過Liposome 2000介導，該質粒被轉染到MC3T3-E1細胞中。經3 d培養后，通過定量PCR和蛋白免疫印跡技術，檢測到質粒轉染后的細胞中Raptor mRNA及蛋白水平明顯增加，說明Raptor在MC3T3-E1細胞的過表達得以實現，見圖1。

2.2 過表達Raptor促進MT3T3-E1細胞的成骨分化 在pcDNA3.1-Raptor表達質粒轉染的基礎上，再利用100 ng/ml BMP-2對MC3T3-E1細胞進行誘導刺激，檢測14 d后的礦化程度。實驗發現，轉染pcDNA3.1-Raptor并用BMP-2處理的細胞，其茜素紅染色顯示著色更深，說明該組細胞的礦物沉積顯著增加，礦化程度顯著高于pcDNA3.1空載體轉染+BMP-2處理組(圖2)。

利用定量PCR方法檢測mTORC1信號對成骨細胞標記基因表達的影響。結果顯示，同樣的BMP-2處理條件下，pcDNA3.1-Raptor轉染組的成骨細胞特異性標記基因的表達均顯著升高。具體表現為，在BMP-2處理7 d和14 d后，pcDNA3.1-Raptor組的一型膠原蛋白基因ColⅠ，骨鈣素基因Ocn，骨涎蛋白基因Bsp，其mRNA水平都顯著高于pcDNA3.1空載體轉染組(圖3)。因此，我們認為，過表達Raptor蛋白，激活mTORC1信號能極大地促進成骨細胞特異性標記基因的表達。

圖1 Raptor在MC3T3-E1細胞的過表達Fig.1 Overexpression of Raptor in MC3T3-E1Note: *.P<0.001，n=5.

進一步探討過表達Raptor對成骨細胞的關鍵轉錄因子Runx2，Osx以及ATF4基因表達的影響。定量PCR實驗顯示，在BMP-2處理7 d和14 d的情況下，pcDNA3.1-Raptor組的Runx2、Osx以及ATF4的mRNA水平都顯著高于pcDNA3.1空載體轉染組(圖4)。因此，我們認為過表達Raptor蛋白以激活mTORC1信號能顯著促進成骨細胞的關鍵轉錄因子Runx2、Osx以及ATF4的基因表達。

2.3 MC3T3-E1細胞的Raptor基因沉默 通過Liposome 2000介導，Raptor siRNA被轉染到MC3T3-E1細胞中。經過3 d培養后，通過定量PCR和免疫印跡技術，我們檢測到質粒轉染后的細胞中Raptor的表達量顯著降低，說明Raptor在MC3T3-E1細胞的基因沉默得以實現(圖5)。

2.4 Raptor基因沉默抑制MC3T3-E1的成骨分化 在Raptor基因沉默的基礎上，再利用100 ng/ml BMP-2對MC3T3-E1細胞進行誘導刺激，檢測14 d后的礦化程度。實驗發現，轉染Raptor siRNA并用BMP-2處理的細胞，其茜素紅染色顯示著色較淺，說明該組細胞的礦物沉積顯著降低，礦化程度顯著低于BMP-2處理組(圖6)。

圖2 過表達Raptor促進MT3T3-E1細胞的礦化Fig.2 Overexpression of Raptor promoted mineralizaion of MC3T3-E1

圖3 過表達Raptor促進ColⅠ、Ocn和Bsp基因表達Fig.3 Overexpression of Raptor promoted gene expression of ColⅠ,Ocn and BspNote: *.P<0.05；**.P<0.01，n=5.

圖4 過表達Raptor促進成骨細胞轉錄因子Runx2、Osx和ATF4的表達Fig.4 Overexpression of Raptor promoted gene expression of transcription factor Runx2,Osx and ATF4Note: *.P<0.05；**.P<0.01，n=5.

圖5 Raptor在MC3T3-E1的基因沉默Fig.5 Gene silence of Raptor in MC3T3-E1Note: ***.P<0.001，n=5.

進一步探討Raptor基因沉默對成骨細胞標記基因表達的影響。結果顯示，同樣的BMP-2處理條件下， Raptor siRNA轉染組的成骨細胞特異性標記基因的表達均顯著降低。具體表現為，在BMP-2處理7 d和14 d后， Raptor siRNA組的一型膠原蛋白基因ColⅠ，骨鈣素基因Ocn，骨涎蛋白基因Bsp,其mRNA水平都顯著低于單獨BMP-2處理組(圖7)。因此，我們認為，通過Raptor基因沉默，抑制mTORC1信號能顯著抑制成骨細胞特異性標記基因的表達。

定量PCR實驗顯示，在BMP-2處理7 d和14 d的情況下，Raptor siRNA組的Runx2、Osx以及ATF4的mRNA水平都顯著低于單獨BMP-2處理組(圖8)。因此，我們認為通過Raptor基因沉默以抑制 mTORC1信號能顯著抑制成骨細胞的關鍵轉錄因子Runx2、Osx以及ATF4的基因表達。

圖6 Raptor 基因沉默降低MC3T3-E1礦化水平Fig.6 Gene silence of Raptor reduced mineralization of MC3T3-E1

圖7 Raptor基因沉默抑制ColⅠ、Ocn和Bsp基因表達Fig.7 Gene silence of Raptor reduced gene expression of ColⅠ,Ocn and BspNote: *.P<0.05；**.P<0.01，n=5.

圖8 Raptor基因沉默抑制成骨細胞轉錄因子Runx2、Osx和ATF4的表達Fig.8 Gene silence of Raptor reduced gene expression of transcription factor Runx2,Osx and ATF4

3 討論

間充質干細胞的成骨分化是骨骼發育以及骨質維持的重要過程。盡管對成骨分化的研究已經揭示了部分分子調控機理，包括BMPs以及Wnts等重要信號通路的發現，Runx2等關鍵轉錄因子的轉錄機制闡明等[3,6]，然而，目前對成骨分化的分子調控過程的了解依然不足。

本實驗探討了mTORC1信號對成骨分化的調控作用。實驗結果顯示，通過Raptor過表達激活mTORC1信號能顯著增加MT3T3-E1細胞骨礦化程度，并顯著促進了成骨分化的特異性標記基因ColⅠ、Ocn、Bsp的基因表達，以及促進成骨轉錄因子Runx2和Osx以及ATF4的基因表達。說明過表達Raptor，激活mTORC1信號能顯著促進MT3T3-E1細胞的分化成熟。與此同時，通過Raptor基因沉默以抑制mTORC1信號，顯著降低了MT3T3-E1細胞骨礦化程度，并顯著抑制了成骨分化的特異性標記基因ColⅠ、Ocn、Bsp的基因表達，以及抑制成骨轉錄因子Runx2和Osx以及ATF4的基因表達。說明通過Raptor基因沉默以抑制mTORC1信號能顯著抑制MT3T3-E1細胞的分化成熟。Chen等[10]研究發現，Wnt7B能通過激活mTORC1信號通路進而促進間充質干細胞的成骨分化。另外，Zhan等[15]通過采用雷帕霉素研究發現mTORC1信號參與調控血管平滑肌細胞的成骨分化。上述文獻報道結果與本研究結論類似。說明已有越來越多的證據支持mTORC1對成骨分化具有促進作用的論斷。

骨重建對骨骼的維持和再生起到關鍵作用[6]。骨重建的失衡則會導致骨質疏松等骨骼疾病。骨質疏松的基本原因是破骨吸收過強而成骨不足，最終導致骨質丟失，骨量下降，從而形成骨質疏松[16,17]。目前對骨質疏松治療的主要思路是抑制骨質吸收，減少骨質流失[18]。而通過促進骨質合成從而對骨質疏松進行治療被認為是一條新的思路[19,20]。但是對于如何促進骨質合成，增加骨量目前尚無有效方法。本實驗證實了mTORC1信號能顯著促進成骨分化，因而，推測提高mTORC1信號在人體前成骨細胞中的水平能相應地促進成骨分化，增加骨質的合成。因此， mTORC1信號具有成為骨質疏松治療靶點的潛在可能。

綜上所述，本實驗通過在MT3T3-E1細胞中過表達和基因沉默mTORC1信號關鍵蛋白Raptor，激活或抑制mTORC1信號，印證了mTORC1對前成骨細胞向成熟的成骨細胞分化的正向調控作用。本研究揭示了一種新的成骨分化的分子細胞機制，并為日后開發促進骨質合成的藥物提供了新的思路。

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[收稿2016-03-26 修回2016-06-08]

(編輯 許四平)

mTORC1 signaling promotes osteoblast differentiation of preosteoblast MC3T3-E1

ZHANG Jing-Jing,ZHANG Nan,WU Wei,WANG Peng,YANG Jing-Rui,DUAN Ju-Hong,YU Hai-Chuan.

Collaborative Innovation Center of Henan Province,Institute of Medical Laboratory Science and Molecular Diognostics and Medical Laboratory Technology,Xinxiang 453003,China

Objective:To investigate the regulatory role of mTORC1 signaling on osteoblast differentiation from preosteoblast cell MC3T3-E1.Methods: To overexpress the gene Raptor,which was a critical component of mTORC1 signaling,pcDNA3.1-Raptor was transfected to preosteoblast cell MC3T3-E1.The Raptor overexpression was confirmed by Real-time PCR and Western blot.For the gene silence of Raptor,Raptor siRNA was transfected to preosteoblast cell MC3T3-E1.Alizarin red staining was used to detect the mineralization of MC3T3-E1.Real-time PCR was used to detect the gene expression of osteoblast specific marker genes.Western blot was used to detect the protein level of Raptor.Results: Compared to the control group,the levels of Raptor mRNA and proteins increased significantly in the Raptor overexpression group;the Alizarin red staining results revealed darker staining in the Raptor overexpression group,suggesting higher level of mineralization;the Real-time PCR results showed that the expression of osteoblast differentiation marker genes and osteoblast transcription factors in the Raptor overexpression group was higher than the control group.Compared to the control group,the levels of Raptor siRNA and proteins decreased significantly in the Raptor siRNA group;the Alizarin red staining results revealed lighter staining in the Raptor siRNA group,indicating lower level of mineralization;the real-time PCR results showed that the expression of osteoblast differentiation marker genes and osteoblast transcription factors in the Raptor siRNA group was lower than the control group.Conclusion: mTORC1 signaling promoted the osteoblast differentiation from preosteoblast cell MC3T3-E1.

mTORC1;Osteoblast differentiation;Preosteoblast

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.002

①本文為國家自然科學基金項目(No.31301135)。

張婧婧(1982年-)，女，碩士，實驗師，主要從事分子免疫方面的研究。

及指導教師：于海川(1979年-)，男，博士，副教授，主要從事造血免疫分化方面的研究，E-mail：15225991758@163.com。

R329.24

A

1000-484X(2016)11-1573-05

②河南省新鄉醫學院，新鄉453003。

③河南省新鄉醫學院第三附屬醫院，新鄉453003。