金黃色葡萄球菌誘導的乳腺炎小鼠脾臟Th細胞變化研究①

趙燕清 高 洋 張洪杰 方 琳 陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌712100)

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金黃色葡萄球菌誘導的乳腺炎小鼠脾臟Th細胞變化研究①

趙燕清②高 洋 張洪杰 方 琳 陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌712100)

目的：在小鼠金黃色葡萄球菌性乳腺炎過程中，探討脾臟內多種Th細胞亞群數(shù)量和相關細胞因子、轉錄因子的動態(tài)變化及其意義。方法：本研究首先建立S.aureus感染小鼠的乳腺炎模型，再利用流式細胞術和熒光定量PCR技術，分別檢測脾臟中多種Th細胞亞群數(shù)量及相關因子mRNA水平。結果：在S.aureus感染小鼠乳房后的不同時間，脾臟內Th2細胞和Th17細胞占CD4+淋巴細胞的比例分別顯著增加(P<0.05)，而Treg細胞比例則明顯降低(P<0.05)。并且，與Th細胞分化、活化和效應相關的多種細胞因子及轉錄因子，均在轉錄水平有明顯升高(P<0.05)。結論：乳腺炎不只是發(fā)生于乳腺局部的一種炎癥反應，機體還能夠調動脾臟的多種Th淋巴細胞亞群，以分泌細胞因子的方式，組織有效的乳腺抗S.aureus感染免疫應答。

乳腺炎；Th細胞亞群；脾臟；金黃色葡萄球菌；小鼠

乳腺炎是人和其他多種哺乳動物泌乳期的常見疾病。全球約10%的哺乳期婦女患有乳腺炎[1]，奶牛和奶山羊的乳腺炎發(fā)病率分別為10%～74%、9%～50%[2-4]，駱駝、貓、狗、豬和家兔等哺乳動物均有報道患有乳腺炎[5-7]。乳腺炎不僅影響母體健康，還可能通過乳汁將病原菌傳遞給新生個體使其感染發(fā)病甚至死亡。牛羊患乳腺炎不僅泌乳量大大降低，且乳汁及乳制品質量下降。細菌感染是引發(fā)乳腺炎的主要原因，最常見的乳腺炎病原菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)，其感染常造成臨床乳腺炎、隱性乳腺炎和慢性乳腺炎，偶爾引起壞疽性乳腺炎[8]。S.aureus能夠形成菌膜并在上皮細胞和巨噬細胞內存活，抗生素療法不能有效控制S.aureus乳腺炎。目前，針對S.aureus引起的乳腺炎，臨床上仍然沒有十分有效的預防和治療方法，關鍵問題在于乳腺炎免疫應答機制不清楚。本研究首先建立小鼠的S.aureus乳腺炎模型，通過脾臟中多種Th細胞亞群數(shù)量及特異性細胞因子mRNA水平的檢測，以探討其在乳腺抗感染免疫中的動態(tài)變化意義，為從免疫學角度防治乳腺炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 雌性C57BL/6小鼠購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。自由交配后，取分娩7～10日齡的母鼠建立S.aureus乳腺炎模型。S.aureus是本實驗室保存菌株，從臨床采集的奶山羊乳腺炎樣品中分離得到。

小鼠淋巴細胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自HyClone公司；胎牛血清購自Gibco公司；流式抗體FITC anti-CD4 antibody (Ab)、APC anti-CD25 Ab、PE anti-IL-17A Ab、APC anti-IFN-γ Ab、Percp/cy5.5 anti-IL-4 Ab及流式標記緩沖液購自Biolegend公司；總RNA提取試劑RNAiso Plus，反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser和熒光染料SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均購自TaKaRa公司。FACSAria流式細胞儀購自BD Biosciences公司；iQ5熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立小鼠乳腺炎模型S.aureus復壯培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落接種至LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)6 h。3 500 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，PBS緩沖液重懸后平板菌落計數(shù)法計數(shù)CFU(Colony-forming units)。將S.aureus調整為4 × 107CFUs/ml菌體懸液，用于小鼠乳房注射。

為使乳房充盈乳汁，將分娩7～10日齡的母鼠與仔鼠分別飼養(yǎng)。1～2 h后，氯胺酮(100 mg/kg體重)腹腔注射，麻醉母鼠。75%酒精消毒母鼠腹部。將母鼠第四對乳房分別注射4 × 106CFUs/0.1 mlS.aureus懸液。在細菌感染6 h，將仔鼠放回，與母鼠共同飼養(yǎng)。設置對照組為麻醉后僅PBS緩沖液注射乳房的哺乳期母鼠。

1.2.2 病理組織學觀察 分別在S.aureus感染乳房的1、3、5和7 d，脫頸椎處死小鼠。無菌解剖小鼠，觀察乳腺局部病理變化。摘取一側乳腺，4%多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色后光學顯微鏡進行病理組織學的觀察分析。

1.2.3 分離小鼠脾臟淋巴細胞 無菌摘取小鼠脾臟，研磨后200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾。將單細胞懸液疊加于等體積淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心20 min。吸取中間云霧層的淋巴細胞，PBS洗滌兩次，重懸于含10%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基。調整細胞密度為1 × 106個/ml，備用。

1.2.4 流式細胞術檢測 在布雷菲德菌素A(10 μg/ml)存在時，以佛波酯(50 ng/ml)和離子霉素(1 μg/ml)共同刺激已經(jīng)制備的脾臟淋巴細胞懸液，5%CO237℃培養(yǎng)6 h。收集并離心洗滌細胞一次，重懸于細胞標記緩沖液中，與FITC anti-CD4 Ab和APC anti-CD25 Ab室溫避光孵育20 min，進行細胞表面分子染色標記。經(jīng)細胞固定及破膜后，將脾臟淋巴細胞與PE anti-IL-17A Ab、APC anti-IFN-γ Ab和Percp/cy5.5 anti-IL-4 Ab室溫避光共孵育20 min，進行細胞內分子染色標記。經(jīng)細胞標記緩沖液洗滌并重懸，上機，流式細胞儀檢測。設置同型陰性對照抗體為對照組。

1.2.5 熒光定量PCR檢測多種細胞因子mRNA表達 無菌采集小鼠脾臟，研磨，RNAiso Plus裂解細胞后，經(jīng)氯仿-異丙醇法分離得到總RNA。將1 μg 總RNA按照反轉錄試劑盒說明書制備為cDNA。按照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明書，進行PCR反應。反應體系為：SYBR Mix 10 μl、cDNA 4 μl、上下游引物各0.4 μl、ddH2O 5.2 μl。反應條件為：95℃ 5 min，40個循環(huán)(95℃ 15 s、58℃ 30 s)或95℃ 5min，40個循環(huán)(95℃ 15 s、58℃ 15 s、72℃ 20 s)。以2-ΔΔCt表示試驗數(shù)據(jù)。Real-time PCR引物見表1。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，并作圖。對照組和試驗組數(shù)據(jù)運用一維方差分析或t檢驗進行差異分析，以P<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺炎模型小鼠組織病理學測定結果 病理解剖顯示，對照組小鼠乳腺乳汁充盈，質地均一(見圖1A)。試驗組小鼠乳腺呈蜂窩狀，有局限性膿液積聚(見圖1B)。病理組織切片顯示，S.aureus感染小鼠乳腺組織退化萎縮，腺泡壁增厚，腺泡上皮增生，上皮細胞排列紊亂甚至脫離基底膜進入腺泡腔。中性粒細胞和淋巴細胞侵入腺泡腔(見圖1D)。結果表明，成功建立了小鼠乳腺炎模型。

2.2 Th1細胞及相關細胞因子、轉錄因子的檢測結果 與對照組比較，脾臟Th1細胞(CD4+IFN-γ+)占CD4+淋巴細胞比例在S.aureus感染乳腺的3 d略有增加，IFN-γ mRNA在S.aureus感染乳房的5 d略有上升(P>0.05)。Th1細胞特異性轉錄因子T-bet mRNA在S.aureus感染乳房的3、5 d顯著增加；促進Th1細胞分化并活化的細胞因子IL-12 mRNA在細菌感染乳房的3、5和7 d明顯增加(P<0.05，圖2)。

表1 Real-time PCR所用引物及擴增片段大小

Tab.1 Primers and respective amplified product size used for Real-time PCR

GeneGenBankaccessionNoSequence(5′?3′)Ampliconsize(bp)Reference2?stepPCRGapdhNM＿008084F：ACCTGCCAAGTATGATGAC119[9]R：GGGAGTTGCTGTTGAAGTIl17NM＿010552F：CTCCAGAATGTGAAGGTC89[9]R：GAACGGTTGAGGTAGTCTIl1bNM＿008361F：GAATCTATACCTGTCCTGTGTAA130R：GCTCTTGACTTCTATCTTGTTGIl12aNM＿001159424F：AACGCAGCACTTCAGAAT108R：CAGAGTCTCGCCATTATGATIl6NM＿031168F：AGAAGGAGTGGCTAAGGA187R：GAGAACAACATAAGTCAGATACTbx21NM＿019507F：ACCAGAGCGGCAAGTGGG69[10]R：TGGACATATAAGCGGTTCCCTGTgfb1NM＿011577F：TGACGTCACTGGAGTTGTACGG169[11]R：GGTTCATGTCATGGATGGTGCIl10NM＿010548F：AAGGACCAGCTGGACAACAT172[12]R：TCTCACCCAGGGAATTCAAACCR6NM＿009835F：GGTTCATCTCCATCATCATCT81R：GCTCACAGACATCACGATIl4NM＿021283F：TCAACCCCCAGCTAGTTGTC199[13]R：CGAGCTCACTCTCTGTGGTGRorcXM＿005357024F：CCGCTGAGAGGGCTTCAC241[14]R：TGCAGGAGTAGGCCACATTACA3?stepPCRIfngNM＿008337F：ATCTGGAGGAACTGGCAAAA246[13]R：TGAGCTCATTGAATGCTTGGIl23aNM＿031252F：AGCGGGACATATGAATCTACTAAGAGA244[15]R：GTCCTAGTAGGGAGGTGTGAAGTTG

圖1 小鼠乳腺解剖及組織切片觀察(×40)Fig.1 Representative appearance of murine mammary gland(×40)Note: A.Mammary gland of healthy mice；B.S.aureus infected mice;C.Histological section of mammary gland from healthy mice；D.S.aureus infected mice;Arrows in figure B indicate abscesses,and arrow in figure D indicates neutrophil.

2.3 Th2細胞及相關細胞因子的檢測結果 與對照組比較，脾臟Th2細胞(CD4+IL-4+)占CD4+淋巴細胞比例在S.aureus感染乳房的1 d顯著增加，在1 d 后遞減。IL-4 mRNA在細菌感染乳房的5 d明顯高于正常對照組(P<0.05，圖3)。

2.4 Th17細胞及相關細胞因子、轉錄因子的檢測結果 脾臟Th17細胞(CD4+IL-17+)占CD4+淋巴細胞比例在S.aureus感染乳房的3 d顯著增加(P<0.05)。Th17細胞特異性的轉錄因子RORγt mRNA在細菌感染乳房的5 d顯著升高(P<0.05)，但促炎性細胞因子IL-17 mRNA在細菌感染乳房的5 d顯著低于正常對照組(P<0.05)。與Th17細胞分化、活化相關的細胞因子，如TGF-β、IL-6和IL-1β，分別在細菌感染乳房的不同時間顯著增加轉錄的mRNA(P<0.05)。雖然細胞因子IL-23也參與Th17細胞活化，促進IL-17產(chǎn)生，但是試驗組與對照組在轉錄水平比較無明顯差異。此外，CCR6是表達于Th17細胞膜表面、與Th17細胞的趨化募集有關的蛋白，本研究脾臟中CCR6 mRNA在S.aureus感染乳腺的5 d顯著高于對照組(P<0.05)。見圖4。

圖2 被感染小鼠脾臟中Th1細胞占CD4+淋巴細胞比例與相關細胞因子、轉錄因子mRNA水平的動態(tài)變化Fig.2 Dynamics of proportion of Th1 cells in CD4+ lymphocytes and mRNA expression of Th1-related cytokines and transcription factor in spleen of infected mice

圖4 被感染小鼠脾臟中Th17細胞占CD4+淋巴細胞比例與相關細胞因子、轉錄因子mRNA水平的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of proportion of Th17 cells in CD4+ lymphocytes and mRNA expression of Th17-related cytokines and transcription factor in spleen of infected mice

圖3 被感染小鼠脾臟中Th2細胞占CD4+淋巴細胞比例與IL-4 mRNA水平的動態(tài)變化Fig.3 Dynamics of proportion of Th2 cells in CD4+ lymphocytes and IL-4 mRNA expression in spleen of infected mice

圖5 被感染小鼠脾臟中Treg細胞占CD4+淋巴細胞比例與IL-10 mRNA水平的動態(tài)變化Fig.5 Dynamics of proportion of Treg cells in CD4+ lymphocytes and IL-10 mRNA expression in spleen of infected mice

2.5 Treg細胞數(shù)量及分泌細胞因子的檢測結果 與對照組比較，脾臟Treg細胞(CD4+CD25+)占CD4+淋巴細胞比例在S.aureus感染乳房的3、5和7 d顯著降低(P<0.05)。而IL-10 mRNA在S.aureus感染乳房的5 d顯著高于對照組(P<0.05，圖5)。

3 討論

脾臟是機體最重大的外周免疫器官，也是適應性免疫應答發(fā)生的主要場所。脾臟內定居著大量成熟的T淋巴細胞，其中的Th細胞在接受抗原肽-MHC復合物刺激后，當細胞因子微環(huán)境合適時，能夠分別分化為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞和Treg細胞[16]，然后遷移至病原體所在部位，執(zhí)行清除病原體的免疫功能。通常機體被病原體感染后，脾臟Th細胞數(shù)量和亞群比例首先會發(fā)生顯著變化，這種變化也基本反映了機體免疫系統(tǒng)對特定病原體感染的防御機制。因此，要研究機體抗御病原感染的免疫機理，有必要搞清楚脾臟T細胞，尤其是Th細胞的數(shù)量和所占比例在炎癥過程中的變化。基于此，本研究探討乳腺抗S.aureus感染的免疫機制，首先對脾臟的Th細胞亞群變化進行了測定。本研究結果顯示，小鼠乳腺感染S.aureus一周內的不同時間段， Th2和Th17亞群比例明顯升高，與其分化相關的細胞因子mRNA水平也顯著升高，提示Th2和Th17亞群可能是乳腺抗S.aureus感染的主要效應T細胞亞群，Th1亞群可能也參與了這一免疫應答，但它可能處于輔助者的地位。

Th17細胞以分泌IL-17為特征，介導炎癥反應，在多種自身免疫病和清除寄生蟲、胞內細菌感染過程中發(fā)揮重要作用[17]。Th17細胞是否參與乳腺炎特別是S.aureus引起的乳腺炎尚不清楚。本研究揭示，脾臟Th17細胞占CD4+淋巴細胞的比例在S.aureus感染乳房的3 d顯著增加，促進Th17細胞發(fā)育分化的細胞因子TGF-β、IL-6和IL-1β在mRNA轉錄水平明顯升高，介導Th17細胞產(chǎn)生IL-17的重要轉錄因子RORγt mRNA明顯增加。這表明S.aureus感染乳房后，脾臟中成熟Th細胞向Th17細胞發(fā)生了明顯的分化。但與此變化不一致的是脾臟IL-17 mRNA含量明顯減少。我們推測，脾臟產(chǎn)生的Th17細胞尚未分化成Th17效應細胞，受趨化因子影響募集至乳腺組織后，才能夠轉化為大量分泌IL-17的效應Th17細胞。與這一假設相一致的是，我們的檢測結果表明，促進Th17細胞活化分泌IL-17的細胞因子IL-23 mRNA轉錄水平?jīng)]有顯著變化，而與Th17細胞趨化募集相關的細胞表面受體CCR6 mRNA在S.aureus感染乳房的5 d明顯增加。并且，已有研究報道稱，S.aureus感染乳房引起乳腺炎后，IL-17 在乳腺組織腺泡、乳導管、乳池、乳頭管和乳汁內的mRNA轉錄水平及蛋白水平顯著增加[18-20]。驗證這一假設，需要開展進一步的研究。

Th1/Th2是經(jīng)典的輔助性T細胞亞群，Th1細胞介導細胞免疫，而Th2細胞在體液免疫中發(fā)揮重要作用。本研究結果表明，Th2細胞而非Th1細胞占CD4+淋巴細胞的比例在S.aureus感染乳房后顯著增加，細胞因子IL-4而非IFN-γ mRNA轉錄水平明顯升高，揭示體液免疫而非細胞免疫在乳房抗S.aureus感染免疫應答中發(fā)揮重要作用。但是，促進Th1細胞發(fā)育分化的細胞因子IL-12及其關鍵轉錄因子T-bet，在S.aureus感染乳房的3、5 d顯著增加轉錄表達，意味著Th1細胞發(fā)育分化可能是發(fā)生在S.aureus感染乳房的炎癥后期，繼而募集至乳腺局部發(fā)揮清除胞內細菌的作用。S.aureus是兼性胞內寄生菌，在上皮細胞和巨噬細胞內存活，由Th1細胞介導的細胞免疫可能是機體徹底清除S.aureus感染的重要途徑。

Treg細胞被認為是免疫應答的負調節(jié)者。本研究結果表明，脾臟中Treg細胞占CD4+淋巴細胞的比例在S.aureus感染乳房的3 d后顯著降低，暗示對T淋巴細胞分化活化的抑制作用減弱，提示機體增強了抗S.aureus感染免疫應答的炎癥反應。脾臟中抑炎性細胞因子IL-10 mRNA的顯著升高，可以解釋為由Th2細胞產(chǎn)生，適當抑制炎性反應，避免因過度炎癥反應而造成組織病理性損傷。已有研究報道，IL-10能夠嚴格地調控IL-17產(chǎn)生，進而控制中性粒細胞的募集，調節(jié)機體發(fā)揮有效的免疫保護作用而非造成免疫病理性損傷[21]。

綜上所述，乳腺炎并不只是發(fā)生于乳腺局部的一種炎癥反應，機體還能夠調動脾臟的多種輔助性T淋巴細胞亞群，以分泌細胞因子的方式，組織有效的乳腺抗S.aureus感染免疫應答。

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[收稿2016-01-25 修回2016-03-07]

(編輯 倪 鵬)

Dynamics of T helper cell subsets in spleen in a murine Staphylococcus aureus mastitis model

ZHAO Yan-Qing,GAO Yang,ZHANG Hong-Jie,FANG Lin,CHEN De-Kun.

College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China

Objective:To study the dynamics of T helper cell subsets and related cytokines and transcription factors and its significance in spleen in mice during experimentally inducedStaphylococcusaureusmastitis .Methods: We firstly established a murine mastitis model by challenge with an inoculum ofStaphylococcusaureus,and then,the number of each T helper cell subset and the mRNA level of their associated factors were assessed in spleen by flow cytometry and quantitative real-time PCR,respectively.Results: At the indicated time points afterStaphylococcusaureusinfection,the proportion of Th2 cells and Th17 cells in CD4+lymphocytes were significantly increased,respectively,whereas,the proportion of regulatory T cells was significantly decreased (P<0.05).Moreover,the mRNA expression of genes encoding cytokines and transcription factors involved in the differentiation and function of various T helper cells,was greatly elevated in spleen (P<0.05).Conclusion: Mastitis is not only a local inflammation of the mammary gland,but also involved in various T helper cell subsets in spleen via pro-inflammatory cytokine production to mediate effective immune responses againstStaphylococcusaureusinfection in mastitis.

Mastitis;T helper cell subsets;Spleen;Staphylococcusaureus;Mouse

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.004

①本文受陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTTSNY04-04)資助。

趙燕清(1986年-)，女，博士，講師，主要從事感染與免疫及分子免疫學方面研究，E-mail：zhaoyq619@163.com。

及指導教師：陳德坤(1964年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事預防獸醫(yī)學與分子免疫學方面研究，E-mail：chendekun163@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)11-1583-06

②湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院，十堰 442000。