DcR3對肝纖維化動物模型的影響①

潘留蘭 賈勝男 張 倩 柳思琪 邵 雪 金珍婧

(吉林大學第二醫院肝膽胰內科，長春130041)

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DcR3對肝纖維化動物模型的影響①

潘留蘭 賈勝男 張 倩 柳思琪 邵 雪 金珍婧

(吉林大學第二醫院肝膽胰內科，長春130041)

目的：研究DcR3基因對肝纖維化大鼠的預防性治療的作用。方法：SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，體重范圍180～220 g，隨機分為3組，每組10只，分別為正常對照組、DcR3基因預防性治療組(1%DMN+DcR3組)、造模組(1% DMN組)。采用1%DMN誘導大鼠肝纖維化模型，腹腔注射DcR3質粒進行預防性干預。分別采用HE 染色和Masson染色觀察肝組織病理情況；qRT-PCR和Western blot法檢測DcR3、Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1的mRNA和蛋白表達水平。結果：與模型組相比，DcR3預防治療組大鼠肝組織炎性細胞浸潤及膠原類物質沉積有所改善；DcR3基因可顯著降低肝纖維化大鼠Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平，DcR3基因預防性治療組與對照組和造模組有顯著性差異(P<0.05)；同時DcR3基因預防性治療組DcR3 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。結論：DcR3基因可有效防治大鼠肝纖維化，其作用機制可能是DcR3通過降低肝臟炎癥反應，減少膠原類物質沉積，抑制α-SMA和TGF-β1表達，從而抑制HSC活化；下調Fas和FasL表達，抑制Fas/FasL途徑誘導的肝細胞凋亡。

DcR3；肝纖維化；Fas/FasL；α-SMA；TGF-β1

肝纖維化(Hepatic fibrosis)是肝組織內細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)因合成增加、降解相對不足而在肝內異常沉積所導致肝臟結構和功能發生異常改變的一種病理變化，是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌發展所共有的病理改變和必經途徑。因此，阻止或延緩肝纖維化的發生發展是預防和治療慢性肝病以及肝硬化和肝癌的關鍵[1]。目前有關肝纖維化的治療原則主要是抑制肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)活化、調節ECM合成和降解、促進HSC凋亡、抑制肝細胞凋亡及誘導肝細胞再生等。因此，如何清除HSC和降低肝細胞凋亡是使肝纖維化逆轉的關鍵。誘騙受體3(Decoy receptor3，DcR3)是新近發現的腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)家族的新成員，能和腫瘤壞死因子超家族成員Fas配體相結合，通過Fas/FasL途徑對它們介導的細胞凋亡起負調控的作用，在細胞的生長、分化、死亡以及免疫調節等方面發揮重要作用[2,3]。研究發現，DcR3早期應用可抑制肺纖維化動物模型TGF-β的產生，進而延緩或阻止肺纖維化，推測DcR3有可能抑制肝纖維化的發生[4]。本研究通過DcR3干預DMN誘導的大鼠肝纖維化模型，探討DcR3在肝纖維化發生發展中的作用方式，為進一步闡明DcR3對肝纖維化的發生發展作用機制及靶向治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究為單因素隨機試驗， SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，體重范圍180～220 g，購自吉林大學動物實驗中心。隨機分為3組，每組10只，分別為正常對照組、DcR3基因預防性治療組(1%DMN+DcR3組)、造模組(1%DMN組)。RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；反轉錄試劑盒(TaKaRa公司，中國)；兔抗人β-actin抗體(ab8227)、兔抗人DcR3抗體(ab8405)，山羊抗兔二抗(ab6721)(Abcam，英國)；DcR3質粒(本研究室自制)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 造模方法參照文獻[5]肝纖維化造模組和DcR3基因預防性治療組腹腔注射1%DMN，1 ml/kg，每天1次，每周連續3次，共4周，正常對照組注射等體積生理鹽水。造模同時DcR3基因預防性治療組給予DcR3質粒注射120 μg/只。所有實驗動物于最后一次造模后第5天處死，取肝臟樣品，分別置于10%中性福爾馬林固定及液氮中保存。

1.2.2 肝組織形態學觀察 肝組織采用常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，HE染色和Masson染色，觀察肝臟纖維化程度和炎癥程度。

1.2.3 熒光定量反轉錄PCR檢測DcR3、Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1表達量 ①RNA提取：按照試劑盒使用說明書提取肝臟組織總RNA，使用紫外分光光度計(NanoDrop 2000c，Thermo公司)檢測RNA純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定RNA的純度和完整度。②cDNA合成：根據反轉錄試劑盒使用說明書，反應體系為20 μl，反轉錄條件為：65℃變性5 min，37℃反應15 min，95℃酶失活5 min;③qRT-PCR：每個PCR反應體系為20 μl，每個樣本設3個重復，利用Mx3005P熒光定量PCR儀進行熒光定量檢測。引物序列如表1，反應條件：95℃變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環。以β-actin為內參，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達量，Ct值為閾值，ΔCt=Ct基因-Ct內參，ΔΔCt=ΔCt-ΔCt陰性對照。

表1 熒光定量引物序列

Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

NameSequences(5′?3′)Length(bp)DCR3F：CGCTGGTTTCTGCTTGGAG122R：AGCTGCTGGCTGAGAAGGTGFasF：CCGGTTTGGCAATTCTATTT148R：TCGGCAGTTCTCCAGATGTAFasLF：GGTTGCCTTGGTAGGATTGG196R：CCTTGAGTTGGACTTGCCTGTTα?SMAF：AGGAGGATTCCGTGCTGTTC312R：TGGGCTTGATGTTATCTGATTTTGF?β1F：TACTACGCCAAGGAGGTCAC143R：AGCAACACGGGTTCAGGTβ?actinF：CGGCTACAGCTTCACCACCA143R：CGGGCAGCTCGTAGCTCTTC

1.2.4 Western blot檢測DcR3、Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1蛋白的變化 將少量肝臟組織置于1～2 ml勻漿器中，加入裂解液后進行勻漿，然后在4℃下12 000 r/min離心5 min，，取上清液利用BCA試劑檢測蛋白濃度，加入5×loading Buffer混勻，98℃變性10 min，經15%的SDS-PAGE分離，濕轉90 min后，利用5%的脫脂奶粉封閉液封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育1.5 h，利用tanon 5200全自動化學發光/熒光圖像分析系統檢驗蛋白圖像。

2 結果

2.1 肝組織形態學觀察結果 肝組織HE和Masson染色見圖1，由圖可知，正常對照組大鼠肝組織結構清晰，肝細胞大小均勻，無變性、壞死，肝小葉結構完整，未見明顯的膠原類物質沉積；與對照組相比，肝纖維化模型組肝組織結構被破壞，肝細胞出現廣泛的脂肪變，膠原類物質增多，且呈彌散分布，同時可見炎性細胞浸潤；與模型組相比，DcR3預防治療組肝臟病變程度有所改善，可見輕微肝組織細胞變性，肝細胞脂肪變性及膠原類物質沉積。

2.2 DcR3、Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1mRNA表達水平檢測 DcR3基因對大鼠肝纖維化模型DcR3 mRNA水平表達的影響見圖2。與模型組和正常對照組相比較，DcR3基因預防性治療組DcR3 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。DcR3基因對大鼠肝纖維化模型Fas、FasL α-SMA和TGF-β1 mRNA水平的表達有顯著影響，圖3表明，與正常對照組和1%DMN造模組相比， DcR3基因預防性治療組Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1 mRNA表達水平顯著高于正常對照組而低于1%DMN造模組(P<0.05)。

圖1 HE染色和Masson染色觀察各組肝纖維化及炎癥程度Fig.1 Histopathological changes of fibrosis between groups(HE and Masson′s trichromic staining)Note: 1.Fat droplet;2.Collagen.

圖2 肝臟中DcR3 mRNA 表達量Fig.2 Expression of DcR3 mRNA in liver

圖3 肝臟中Fas、 FasL、 α-SMA、 TGF-β mRNA表達量Fig.3 Expression of Fas,FasL,α-SMA and TGF-β mRNA in liverNote: A.Fas；B.FasL；C.α-SMA；D.TGF-β.*.P<0.05，compared with normal group；△.P<0.05,compared with 1% DMN+DcR3.

圖4 肝臟中DcR3、Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1蛋白表達量Fig.4 Expression of DcR3,Fas,FasL,α-SMA and TGF-β1 protein in liver

2.3 DcR3、Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1蛋白的變化 由圖4可知，與正常對照組和DcR3基因預防性治療組相比，造模組Fas、FasL、α-SMA和TGF-β1蛋白含量顯著升高(P<0.05)；與正常對照組和造模組相比，DcR3基因預防性治療組DcR3蛋白含量顯著升高(P<0.05)。

3 討論

肝纖維化是由于各種肝臟病變長期反復發作引起的一種與肝細胞損傷密切相關的病理變化。肝細胞持續損傷導致肝細胞凋亡、肝星狀細胞激活，進而合成細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)[5]。目前研究認為，炎癥反應在肝纖維化發生發展中起著重要的作用[6]。肝臟損傷時，庫普弗細胞被激活并釋放大量炎癥介質介導炎性因子，進而刺激HSCs增殖，合成膠原，增加纖維化的形成[7]。此外Xu等[8]研究發現，華支睪吸蟲感染后引起的肝臟炎癥反應可通過提高α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ膠原蛋白及TIMP-1的轉錄水平進而促進肝纖維化的形成，進一步證實了炎癥反應能夠參與肝纖維化的發生。轉化生長因子-β (Transforming growth factor-β,TGF-β1)是肝纖維化最關鍵的細胞因子，它與肝纖維化發生發展、 EMC代謝關系最為密切。學者們在肝纖維化疾病的大量研究中證明了TGF-β1在肝纖維化形成、發生及發展中有著重要的作用[9]。本研究發現，DcR3干預后，肝纖維化大鼠肝組織炎性細胞浸潤減少，肝脂肪變性及膠原類物質沉積有所改善。同時，肝組織TGF-β1的表達水平明顯降低，這可能是DcR3的應用抑制了肝纖維化大鼠模型的炎癥反應，降低了TGF-β1的表達水平。我們還發現DcR3能夠降低肝纖維化大鼠肝組織中的α-SMA mRNA及蛋白的表達，其原因可能是DcR3抑制TGF-β1的表達可間接抑制HSC的激活，進而降低α-SMA的表達。

進一步研究發現，Fas/FasL途徑介導的細胞凋亡在肝纖維化的發生發展中也扮演重要角色。現已證實，在肝纖維化中Fas、FasL因子表達呈增長趨勢[10]。孫立華等[11]通過檢測慢性乙型肝炎患者肝組織Fas表達，證實肝組織炎癥與Fas表達有關，Fas/FasL介導的細胞凋亡可能參與了慢性乙型肝炎的病理過程[11]。另外一方面，Fas在肝組織中的過度表達是引起肝細胞炎癥壞死和肝纖維化的機制之一。有研究結果顯示，Fas、FasL隨肝臟炎癥活動度及肝纖維化程度加重而增高，尤其在匯管區周圍小葉內及周邊碎屑狀壞死區更明顯[12]。研究發現DcR3可與Fas競爭結合其相應配體FasL,進而抑制細胞凋亡[13]。Mark等[14]用DcR3類似物治療FasL誘導的鼠肺部炎癥反應，結果提示DcR3類似物顯著降低炎癥反應，進一步證實了DcR3可拮抗Fas/FasL誘發的炎癥反應。我們的前期研究表明，DcR3處理能夠抑制肝細胞中Fas和Fasl的表達水平，進而抑制肝細胞的凋亡。本研究發現，DcR3的應用顯著抑制肝纖維化大鼠肝組織中Fas、FasL的mRNA和蛋白表達水平。而DcR3能夠與Fas競爭性結合Fasl，進而導致Fasl及Fas的表達水平降低，進一步抑制了Fas/Fasl誘導的肝細胞凋亡，這可能是DcR3具有改善肝纖維化的作用機制之一。

根據本研究的結果，我們推測在肝纖維化形成過程中，DcR3可能通過降低炎癥反應及膠原類物質沉積，抑制α-SMA和TGF-β1表達，從而抑制HSC活化；下調Fas和FasL表達，進而抑制Fas/FasL途徑誘導的肝細胞凋亡，起到預防阻止肝纖維化發生發展的作用。

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[收稿2016-04-20 修回2016-08-01]

(編輯 許四平)

Effect of DcR3 on animal models of liver fibrosis

PAN Liu-Lan,JIA Sheng-Nan,ZHANG Qian,LIU Si-Qi,SHAO Xue，JIN Zhen-Jing.

Hepatic and biliary pancreatic medicine，the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041，China

Objective:To study the preventive therapy effect on DcR3 gene on hepatic fibrosis rats.Methods: 30 healthy male Wistar rats were divided into 3 groups randomly which weight were 180-200 g:control group,DcR3 treatment group and hepatic fibrosis group.Hepatic fibrosis was induced by 1% DMN intraperitoneal injection in hepatic fibrosis group and DcR3 treatment group.The plasmid transfected DcR3 was intraperitoneal injected in DcR3 group.All rats were killed at the end of 4th week.Then the livers pathology were used to make HE and Masson staining.The mRNA and protein level of DcR3,Fas,FasL,α-SMA and TGF-β1 were measured by qRT-PCR and Western blot respectively.Results: Compared with model group,DcR3 improved the inflammatory cell infiltration and collagen deposition of liver in the rats of the DcR3 group.The mRNA and protein level of Fas,FasL,α-SMA and TGF-β1 were significantly reduced in DcR3 group compared with hepatic fibrosis group(P<0.05).Meanwhile,the mRNA and protein levels of DcR3 was significant increase in DcR3 group (P<0.05).Conclusion: DcR3 could inhibit hepatic fibrosis efficiently by reducing the inflammatory response and collagen deposition,suppressing the expression of α-SMA and TGF-β1,inhibiting HSC activin,down-regulating Fas/FasL and suppressing the hepatocyte apoptosis induced by Fas/FasL pathway.

DcR3;Hepatic fibrosis;Fas/FasL;α-SMA;TGF-β1

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.005

潘留蘭(1959年-)，女，博士，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事慢性肝病的診斷、治療與預防的研究，E-mail:woshipanliulan@126.com。

及指導教師：金珍婧(1965年-)，女，博士，教授，主要從事消化系統疾病診治方面的研究，E-mail: jinyu0429@sina.com。

R392

A

1000-484X(2016)11-1589-04

①本文為吉林省科學技術委員會面上基金課題(201115083)。