激活核受體PXR促進小鼠GM-CSF來源的樹突狀細胞的分化①

邱懷娜 查賀飛 曲佳樂 王 梅 李 璐 齊艷偉 黃 俊 楊 權

(廣州醫科大學基礎學院病原生物學與免疫學教研室，廣州醫科大學中法霍夫曼免疫研究所，廣州511436)

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激活核受體PXR促進小鼠GM-CSF來源的樹突狀細胞的分化①

邱懷娜 查賀飛 曲佳樂 王 梅 李 璐 齊艷偉 黃 俊 楊 權

(廣州醫科大學基礎學院病原生物學與免疫學教研室，廣州醫科大學中法霍夫曼免疫研究所，廣州511436)

目的：研究孕烷受體(PXR)激動劑pregnane-16α-carbonitrile(PCN)對小鼠GM-CSF來源樹突狀細胞(DC)分化的影響。方法：建立小鼠DC體外GM-CSF和IL-4誘導分化體系，并用PCN對體系進行處理。流式細胞術檢測CD11c+DC的比例；ELISA和流式細胞術檢測DC產生細胞因子IFN-γ、IL-1、IL-2和IL-12的量；實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time RT-PCR)檢測調控DC分化相關信號通路基因的表達。結果：成功建立小鼠DC體外分化體系；PCN處理能顯著促進DC分化，且DC產生的細胞因子IFN-γ和IL-2的量顯著增多；Real-time RT-PCR檢測結果表明，與對照組相比，PCN處理組中調控DC分化的Notch和Wnt信號通路相關基因HES1、WISP1和WISP2的表達量顯著上升。結論：PXR激動劑PCN能顯著促進小鼠GM-CSF來源的DC的分化及其IFN-γ和IL-2的產量，并且這種促進作用可能是通過Notch和Wnt信號通路進行調控。

樹突狀細胞；分化；Pregnane X Receptor；Notch信號通路；Wnt信號通路

樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)是由Steinman 于1973年首次在小鼠脾臟中發現，因其具有特殊的星形形態學結構而得名[1，2]。DC是機體內功能最強大的專職抗原提呈細胞，能通過模式識別受體識別外來抗原，并遷移到外周淋巴器官將經其加工后的抗原提呈給T細胞，從而激活初始T細胞，啟動抗原特異性的獲得性免疫反應[3，4]。可以說DC是免疫系統的多能調控者，是連接固有免疫和獲得性免疫反應的重要因子[5]。研究已證實，DC的分化受復雜的信號通路網絡調控，其中包括細胞因子和轉錄因子等[6，7]。近期的研究表明，脂質信號通路在DC分化過程中起到重要的作用，核受體(Nuc-lear receptor)調控的脂類物質與DC分化調控基因表達的變化相關[8]。孕烷受體(Pregnane X receptor,PXR)是核受體超家族中的一員，高表達于肝臟和腸道，低表達于許多其他組織，調節葡萄糖、脂質和膽固醇眾多物質的體內代謝平衡[9]。PXR的激活能誘導藥物代謝酶和相關轉運蛋白的表達，在藥物代謝、肝臟解毒、腸道炎癥以及腫瘤耐藥性方面具有重要作用[10]。PXR同時表達于免疫細胞中[11]，并具有免疫調節和抗炎癥作用，調節免疫細胞的增殖和功能[12-14]。但是目前PXR在DC分化過程中的作用尚無報道。為此，本研究通過使用PXR激動劑PCN處理DC[15]，檢測誘導體系中CD11c+DC的比例、細胞因子分泌量以及調控DC分化的信號通路相關基因的表達，闡述PXR對小鼠DC分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周SPF級雌性C57BL/6小鼠，由廣東省實驗動物中心提供。PBS緩沖液、RPMI1640基礎培養基、胎牛血清(FBS)、β-巰基乙醇和TRIzol購自Invitrogen公司；紅細胞裂解液、青霉素、鏈霉素、氯仿、異丙醇和乙醇購自生工生物工程(上海)股份有限公司；小鼠 GM-CSF和IL-4購自Peprotech公司；PCN和LPS購自Sigma公司；PrimeScript? RT reagent Kit和SYBR? Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司；Real-time RT-RCR引物由Invitrogen公司合成；PE-Cy5標記的抗小鼠CD11c、PE標記的抗小鼠IFN-γ、FITC標記的抗小鼠IL-2流式抗體購自eBioscience公司；ELISA試劑盒購自BD公司；倒置生物顯微鏡購自Leica Microsystems公司；CO2培養箱和Nanodrop2000c儀購自Thermofisher scientific公司；FACS Calibur流式細胞檢測儀購自Beckman Coulter公司；S1000 PCR儀和CFX96 Real-time PCR儀購自Bio-Rad公司；酶標儀購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠DC體外分化誘導 將小鼠快速頸椎脫臼處死，于75%的消毒酒精中浸泡5 min，取脛骨和股骨。將脛骨和股骨兩端輕微剪開，用5 ml注射器吸取適量RPMI1640 培養基，插入骨髓腔，將骨髓細胞完全沖出，得到骨髓細胞懸液；3 500 r/min離心5 min，棄上清；加入3 ml紅細胞裂解液重懸細胞，室溫裂解5 min，加入27 ml PBS緩沖液終止裂解；3 500 r/min離心5 min，棄上清；加入適量RPMI1640 培養基重懸細胞，計數；按細胞數量計算接種孔數，每孔2×106細胞，2 ml培養基；按比例加入各種培養因子，使終濃度為：10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(鏈霉素和青霉素)、50 μmol/L 2-巰基乙醇、20 ng/ml GM-CSF和10 ng/ml IL-4；用RPMI1640 培養基將細胞懸液濃度調整至1×106cells/ml，混勻，接種培養；每隔3 d更換新鮮培養液：吸棄1.8 ml舊培養液，加入2 ml含各種培養因子的新的完全培養液。

1.2.2 藥物處理DC 分為對照組、PCN 20 μmol/L處理組、PCN 40 μmol/L處理組。細胞接種24 h內加藥處理細胞，處理組：加入2 μl溶劑(DMSO)，輕輕混勻；PCN 20 μmol/L處理組：加入2μl的PCN 20 mmol/L儲存液，輕輕混勻；PCN 40 μmol/L處理組：加入2 μl的PCN 40 mmol/L儲存液，輕輕混勻；更換培養液的同時重新加藥處理細胞。對于細胞因子檢測實驗，增加LPS刺激細胞：DC誘導第5天，各實驗組均加入100 ng/ml的LPS處理24 h。

1.2.3 Real-time RT-RCR檢測基因表達 根據實驗需要，收集相應時間點的2×106個待檢測細胞，提取總的RNA并測定濃度和純度，每個實驗組各取100 ng RNA進行逆轉錄；使用PrimeScript? RT reagent Kit進行逆轉錄，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行；使用SYBR? Premix Ex TaqTM進行Real-time PCR，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。各檢測基因引物序列如表1所示，選用β-actin作為內參基因。

1.2.4 流式細胞術檢測DC表型 細胞接種12 h，加入PCN對細胞進行處理。DC誘導第3天，更換新鮮的完全培養基，同時加入相應濃度的PCN處理細胞；DC誘導第6天，收集1×106個待檢測細胞，3 500 r/min離心5 min，棄上清；按說明書用量將適量抗體加入100 μl PBS中，混勻，加入細胞沉淀中，渦旋震蕩15 s；4℃避光孵育30 min；加入3 ml PBS緩沖液終止染色 ，3 500 r/min離心5 min，棄上清；重復洗滌細胞1次；細胞沉淀中加入500 μl含2%多聚甲醛的PBS緩沖液重懸細胞，渦旋混勻；流式細胞儀檢測，讀取50 000個細胞，結果在CellQuest (Becton Dickinson,Mountain View,CA)軟件上進行分析。

表1 Real-time RT-PCR 引物序列

Tab.1 Primers for Real-time RT-PCR detection

GeneForwardprimer(5′?3′)Reverseprimer(5′?3′)Productsize(bp)CYP3A11CACACTTTCCTTCACCCTGCTATCATACGTGGGAGGTGCC110HES1GAGTGCATGAACGAGGTGACCGTTGATCTGGGTCATGCAG109WISP1AGCCTACACTAGTCCCTGGATCTTCCCTGCCTTGATGTGT164WISP2CCAGGAGAATACAGGTGCCAAGGAGTGACAAGGGCAGAAA122β?actinGTGGGAATGGGTCAGAAGGACTTCTCCATGTCGTCCCAGT120

1.2.5 培養上清細胞因子含量檢測 細胞接種12 h，加入PCN對細胞進行處理。DC誘導第3天，更換新鮮的完全培養基，同時加入相應濃度的PCN處理細胞；DC誘導第5天，加入LPS處理細胞。LPS處理24 h后，收集待檢測細胞培養上清，采用ELISA試劑盒檢測相應細胞因子的含量，操作步驟嚴格按照說明書進行，根據標準曲線用間接法計算各實驗組中相應細胞因子的含量(pg/ml)。

1.2.6 流式胞內因子染色 細胞接種12 h，加入PCN對細胞進行處理。DC誘導第3天，更換新鮮的完全培養基，同時加入相應濃度的PCN處理細胞；DC誘導第5天，加入LPS處理細胞。LPS處理24 h后，收集待檢測細胞。將細胞終濃度調至2×106ml，加入佛波醇-乙酸酯(PMA) 20 ng/ml，離子霉素1 μg/ml，渦旋振蕩混勻。37℃，5%CO2培養箱中孵育1 h后，加布雷菲德菌素A(BFA)10 μg/ml繼續孵育4 h。加入2 ml PBS， 4℃、1 860 r/min離心5 min。重復2次。PBS重懸細胞，每管加入2 ml 4%的多聚甲醛，充分混合，避光靜置8 min。PBS洗滌，4℃、2 500 r/min離心5 min。每管加入細胞因子染色液(含Saponin)100 μl，4℃靜置過夜。加入相應熒光標記抗體各1 μl/每管，充分混勻，4℃避光靜置30 min。細胞因子染色液(不含Saponin)2 ml，2 500 r/min離心5 min，重復2次。用細胞因子染色液重懸細胞，流式細胞儀檢測，讀取50 000個細胞。

2 結果

2.1 DC分化過程中PXR靶基因的表達 接種后，收集第0、3、6天的細胞， Real-time RT-RCR檢測PXR靶基因CYP3A11的表達。與第0天相比，誘導培養3 d后的細胞中，CYP3A11的表達量顯著上調(1.2±0.23)與(5.96±0.88)，差異具有統計學意義(P<0.05，圖1)；與第3天相比，誘導培養6 d后的細胞中，CYP3A11的表達量顯著上調(5.96±0.88)與(14.65±1.4)，差異具有統計學意義(P<0.01，圖1)。說明在小鼠骨髓細胞向DC分化的過程中，PXR處于激活狀態，其靶基因表達在分化過程中表達顯著上調。

2.2 PXR激動劑PCN促進DC的分化 細胞接種12 h，加入PCN處理細胞。倒置顯微鏡下觀察，細胞生長狀態良好，說明各實驗組濃度藥物未產生細胞毒作用。收集藥物處理第0天、第3天和第6天的細胞進行Real-time RT-RCR檢測，結果表明，與對照組相比，PCN 20 μmol/L處理組和PCN 40 μmol/L處理組的細胞中CYP3A11的表達在DC分化過程中均顯著上調(P<0.01，P<0.05，圖2)，說明PCN成功激活了PXR。流式細胞術檢測培養體系中CD11c+DC的比例：對照組CD11c+DC細胞的比例為(49.48±4.1)%；PCN 20 μmol/L處理組CD11c+DC細胞的比例為(59.2±7.86)%；PCN40 μmol/L處理組CD11c+DC細胞的比例為(71.25±4.2)%(圖2)。結果表明，PXR激動劑PCN處理能顯著促進培養體系中DC的分化，提高CD11c+DC細胞的比例，差異具有統計學意義(P<0.05)，并且這種促進作用具有濃度依賴性。

2.3 PXR激動劑PCN促進DC產生細胞因子IFN-γ和IL-2 ELISA檢測結果表明，與對照組相比，PCN 40 μmol/L處理組DC培養上清中細胞因子IFN-γ和IL-2的含量顯著上升，差異具有統計學意義(P<0.01、P<0.05，圖3A)；而細胞因子IL-1和IL-12的含量在對照組和PCN 40 μmol/L處理組中無明顯變化，差異不具有統計學意義(P>0.05，圖3A)。流式胞內因子染色檢測結果表明，與對照組相比，PCN 40 μmol/L處理組的CD11c+DC細胞內，細胞因子IFN-γ和IL-2的比例顯著上升，差異具有統計學意義(P<0.01、P<0.05，圖3B)。上述結果表明，PXR激動劑PCN處理能顯著促進培養體系中的CD11c+DC細胞產生細胞因子IFN-γ和IL-2。

圖1 Real-time RT-RCR檢測DC分化過程中CYP3A11的表達Fig.1 Real-time RT-RCR detecting expression of CYP3A11 gene during DC differentiationNote: * .P<0.05 vs 0 d;**.P<0.01 vs 3 d.

圖2 PCN處理后培養體系中CYP3A11的表達和CD11c+ DC細胞的比例Fig.2 Expression of CYP3A11 gene and proportion of CD11c+ DC were measured after PCN treatmentNote: *.P<0.05 vs control group;**.P<0.01 vs control group.

圖3 ELISA和流式細胞術檢測細胞因子IFN-γ、IL-1、IL-2和IL-12的含量Fig.3 Protein levels of IFN-γ,IL-1,IL-2 and IL-12 were measured by ELISA and flow cytometryNote: *.P<0.05 vs control group;**.P<0.01 vs control group;NS.No significance.

圖4 Real-time RT-RCR檢測PCN處理的DC中HES1、WISP1和WISP2的表達Fig.4 Real-time RT-RCR detecting expression of HES1,WISP1 and WISP2 in DC treated with PCNNote: *.P<0.05 vs control group.

2.4 PXR激動劑PCN促進培養體系中HES1、WISP1和WISP2的表達 PCN處理24 h后，Real-time RT-RCR檢測調控DC分化的Notch 和Wnt信號通路相關基因HES1、WISP1和WISP2的表達。與對照組相比，PCN 20 μmol/L處理組和PCN 40 μmol/L處理組細胞中HES1、WISP1和WISP2的表達顯著上調，差異具有統計學意義(P<0.05，圖4)。結果表明， PCN處理能顯著促進細胞中Notch 和Wnt信號通路相關基因的表達，說明PCN對DC分化的調控作用可能與Notch 和Wnt信號通路的激活有關。

3 討論

DC是介導固有免疫反應和啟動獲得性免疫反應的重要免疫細胞，能識別、加工和提呈外來抗原，同時維持免疫耐受，保證在正常生理情況下效應T細胞不會攻擊自身正常細胞或組織產生的抗原[5,16]。研究已證實多種信號通路在DC分化過程中發揮重要的調控作用，其中包括Wnt、Notch、NF-κB以及JAK/STAT等[17-19]。PXR是核受體超家族中的一員，能被多種激動劑激活，從而對其功能進行研究。目前對PXR的研究主要集中在藥物代謝、肝臟脂肪病變、腸道炎癥、肥胖、心血管疾病以及腫瘤藥物反應等領域[10,20，21]，其在免疫系統中的調節作用研究甚少，對DC分化的影響尚未見相關報道。

Zhong等[22]報道核受體LXR(Liver X receptor)激動劑GW3965能通過抑制STAT3信號通路的磷酸化從而促進DC的分化[23]。更有研究報道PCN能誘導抗原提呈細胞中MHCⅡ基因家族成員RT1.B的表達。說明核受體家族在樹突狀細胞的分化過程中可能具有很重要的調控作用。本研究首先成功建立了小鼠骨髓細胞向DC分化的體外誘導體系，并用PXR激動劑PCN處理DC。藥物處理后細胞生長狀態良好，說明本研究使用的藥物濃度并未產生細胞毒作用。本研究發現PXR低表達于小鼠骨髓細胞中(結果省略)，并且在DC分化過程中PXR靶基因CYP3A11表達顯著上調，說明在小鼠骨髓細胞向DC分化的過程中，PXR處于激活狀態，其靶基因CYP3A11對于DC分化可能是一個必需的有利因子。隨后的實驗結果表明，誘導體系經PCN處理后，PXR靶基因CYP3A11表達上調，體系中CD11c+DC的比例顯著上升，并且這種上調作用具有藥物濃度依賴性。本研究結果首次證實了核受體家族中的另一成員PXR能調控小鼠GM-CSF來源的DC的分化。

本研究結果發現，PCN處理能顯著促進DC功能相關細胞因子IFN-γ和IL-2的產量。IFN-γ和IL-2是DC分泌的重要細胞因子，可上調DC 中MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子的表達，促進DC將抗原肽提呈給初始T細胞，促進T、B細胞增殖和分化，啟動獲得性免疫應答反應[24，25]，同時誘導CTL和NK細胞的殺傷活性，在抗病毒和抗腫瘤免疫反應中具有重要作用[26]。有研究表明，PXR可調節免疫反應[13]。從本研究結果推測，PXR激動劑PCN通過促進誘導體系中DC產生IFN-γ和IL-2，而分泌的IFN-γ和IL-2可幫助DC激活多種免疫細胞，從而調節免疫系統反應活性。

本研究結果顯示，PCN處理DC后，調控DC分化的Notch和Wnt信號通路相關基因HES1、WISP1和WISP2表達顯著上調，說明Notch和Wnt處于激活狀態。研究表明，Notch和Wnt信號通路在對DC的分化具有重要的調控作用[27]；Zhou等[17]研究表明在造血祖細胞中激活Notch信號通路可促進DC的分化，而這種促進作用是由Wnt信號通路介導的。Becker等[28]的研究結果發現激活Wnt信號通路能促進DC的產生。由此推測，PXR激動劑PCN可能是通過激活Notch和Wnt信號通路從而促進DC的分化。

綜上所述，本研究結果顯示核受體超家族成員PXR的激動劑PCN能顯著促進小鼠GM-CSF來源DC的分化，促進其產生細胞因子IFN-γ和IL-2，并且這種促進作用可能是通過激活Notch和Wnt信號通路的活性進行調控的。本研究結果為闡明DC分化機制，完善調控DC分化信號通路網絡提供了新的線索；為PXR在免疫系統中的調控作用提供了新的理論依據；為疾病免疫治療方案制定及新藥研發提供了新的思路。

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[收稿2016-04-01 修回2016-05-16]

(編輯 倪 鵬)

Activation of PXR promotes differentiation of mouse GM-CSF derived dendritic cells

QIU Huai-Na,ZHA He-Fei,QU Jia-Le,WANG Mei,LI Lu,QI Yan-Wei,HUANG Jun,YANG Quan.

Department of Pathogen Biology & Immunology,School of Basic Sciences,Guangzhou Medical University;Sino-French Hoffmann Institute,Guangzhou Medical University,Guangzhou 511436,China

Objective:To investigate the influence of Pregnane X Receptor (PXR) agonist pregnane-16α-carbonitrile (PCN) on mouse GM-CSF derived dendritic cell (DC) differentiation.Methods: Mouse DC differentiation was induced by GM-CSF and IL-4 in vitro,and treated with PCN.The proportion of CD11c+DC was measured by flow cytometry;the production of Interferon-γ (IFN-γ),Interleukin-1 (IL-1),Interleukin-2 (IL-2) and Interleukin-12 (IL-12) of DC were analyzed by ELISA and flow cytometry;Real-time RT-RCR was used to detect the expression of genes involved in the signaling pathway which regulated DC differentiation.Results: Mouse DC was successfully induced by GM-CSF and IL-4 in vitro.Treatment of PCN significantly increased the percentage of CD11c+DC and the protein levels of IFN-γ and IL-2 produced by DC were notably enhanced.Real-time RT-RCR results indicated that the expression of Notch and Wnt signaling pathway related genes HES1,WISP1 and WISP2 were up-regulated in PCN treatment group when compared to control group.Conclusion: The PXR agonist PCN can promote the differentiation of mouse GM-CSF derived DC and increased the production of IFN-γ and IL-2 by DC,and Notch and Wnt signaling pathway may play a pivotal role in this process.

Dendritic cells;Differentiation;Pregnane X Receptor;Notch signaling pathway;Wnt signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.006

①本文受廣州醫科大學科學科研項目資助(2015C01)。

邱懷娜(1983年-)，女，博士，講師，主要從事腫瘤分子免疫方面的研究，E-mail：autumn611@163.com。

及指導教師：楊 權(1985年-)，男，博士，講師，主要從事腫瘤分子免疫方面的研究，E-mail：yquangy20 15@163.com。

R392.12 R392.11

A

1000-484X(2016)11-1593-05