miRNA-21-5p調節IL-1β誘導大鼠滑膜細胞凋亡作用機制研究

趙 清

(河南大學附屬淮河醫院,開封475000)

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miRNA-21-5p調節IL-1β誘導大鼠滑膜細胞凋亡作用機制研究

趙 清

(河南大學附屬淮河醫院,開封475000)

目的：探討miRNA-21-5p在由IL-1β所誘導的大鼠滑膜細胞凋亡中的作用機制。方法：將大鼠滑膜細胞進行體外培養，采用甲苯胺藍染色法對Ⅱ型膠原及蛋白多糖進行鑒定；將滑膜細胞分為正常對照組(NC組)，對照組(Control組)，空白質粒轉染組(BL組)以及轉染組(miRNA組)4組。Control、BL和miRNA 3組細胞均經IL-1β誘導處理后采用MTT檢測細胞增殖率，同時采用RT-PCR和Westem blot檢測Bax和Bcl-2表達。結果：所有細胞均能分泌蛋白多糖和Ⅱ型膠原。MTT檢測發現，經IL-1β處理后，miRNA組細胞增殖率顯著低于Control組[(31.6±2.9)%vs(54.7±3.5)%]，差異具有統計學意義(P<0.05)；與Control組相比，miRNA組Bax mRNA及蛋白表達水平顯著增高(1.00±0.31 vs 0.75±0.15，P<0.05)，miRNA組Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(2.24±1.02 vs 1.00±0.64，P<0.05)。結論：miRNA-21-5p可通過促進Bax以及抑制Bcl-2表達，對由IL-1β所誘導的滑膜細胞異常增生起到保護的作用，為治療類風濕性關節炎提供了新的思路。

類風濕性關節炎；miRNA-21-5p；Bax；Bcl-2

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫系統發生功能障礙而導致的疾患，由于大量炎癥因子以及滑膜細胞發生過度的增殖而對關節軟骨造成破壞[1]。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)在RA病理發生過程中起重要作用并可促進滑膜細胞的增殖，故此，如何有效地抑制滑膜細胞的異常增殖，成為控制和治療RA病情的關鍵點[2，3]。體外細胞研究中，常通過IL-6誘導滑膜細胞模擬RA病理過程。miRNA是一類微小RNA，大量的基礎研究證實，miRNA對腫瘤細胞具有一定的調節作用[4-7]。相關研究表明，miRNA-21-5p的過表達對腫瘤的增殖具有抑制效果，但是miRNA-21-5p在RA中的作用機制研究相對有限，本次研究針對miRNA-21-5p對IL-1β所誘導的滑膜細胞發生增殖的作用進行研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級別Wistar雄性大鼠購自南京醫科大學動物中心，脂質體2000(Invitrogen公司，美國)，四甲基偶氮唑藍(MTT)(Sigma 公司，美國)；Bcl-2、Bax以及GAPDH抗體購自美國Snat Cruze 公司；引物序列由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分離與培養大鼠關節滑膜細胞 取5只SPF級別Wistar雄性大鼠，乙醚麻醉后處死，將軟骨片削取后，剪碎用PBS清洗，800 r/min離心5 min，棄除上清液后，將含有5%FBS的濃度為0.04%的Ⅱ型膠原酶加入，37℃水浴過夜，以200目的篩網過濾后，800 r/min離心5 min，再次棄除上清液，然后加入含有10%FBS的DMEM培養基中培養，溫度控制在37℃，在CO2濃度為5%的培養箱中培養，72 h更換培養液。細胞第3代進行所有檢測。

1.2.2 表型鑒定 PBS將爬片清洗2次后，4%的多聚甲醛，在室溫下進行20 min固定后，對蛋白多糖和細胞Ⅱ型膠原表達進行檢測。

1.2.3 細胞處理 將滑膜細胞分為4組：NC組、Control組、BL組以及miRNA組，其中BL組：使用脂質體2000作為載體將慢病毒轉染入滑膜細胞中。miRNA組：使用脂質體2000作為載體將miRNA-21-5p轉染入滑膜細胞中，根據數據庫定義miRNA-21-5p轉染質粒(http://www.mirbase.org/)。NC組和Control組均未進行轉染。

將各組滑膜細胞分別接種在6孔板中直至80%～90%融合，用0.5%FBS培養基代替，使用濃度為10 ng/ml的IL-1β孵育1 h后進行檢測。

1.2.4 MTT檢測 按照四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒中說明書進行操作，測定細胞增殖率。

1.2.5 RT-PCR 采用RT-PCR對Bax和Bcl-2 mRNA表達水平進行檢測，以β-actin作為內參使用。引物序列詳見表1。

1.2.6 Western blot檢測 根據Bcl-2、Bax以及GAPDH抗體說明書步驟對所有組細胞進行檢測。

2 結果

2.1 滑膜細胞鑒定 通過免疫細胞化學染色發現所培養的細胞均能分泌Ⅱ型膠原(圖1)，經甲苯胺藍染色后細胞呈紫色(圖2)。

2.2 miRNA-21-5p在各組中的表達水平 NC組和miRNA組細胞miRNA-21-5p表達水平與Control組相比顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；而BL組和Control組之間無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

2.3 MTT檢測 NC組和miRNA組細胞增殖率[(20.0±8.4)%和(31.6±2.9)%]與Control組(54.7±3.5)%相比顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；而BL組和Control組之間無明顯差異(P>0.05)，見圖4。

2.4 各組Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白表達對比 與Control組相比，miRNA組Bax mRNA及蛋白表達水平顯著增高(1.00±0.31 vs 0.75±0.15，P<0.05)，miRNA組Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(2.24±1.02 vs 1.00±0.64，P<0.05)見圖5、6。

表1 RT-PCR引物序列

Tab.1 RT-PCR primer

GenePrimersequences(5′?3′)Bcl?2AGCGTCAACGGGAGATGTCGTGATGCAAGCTCCCACCAGBaxCAGCTCTGAGCAGATCATGAAGACAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTGAGCβ?actinCGGGACCTGACCGACTACCTGGCCGTGATCTCCTTCTGC

圖1 Ⅱ型膠原Fig.1 Type II collagen

圖2 蛋白多糖Fig.2 Protein polysaccharide

圖3 各組miRNA-21-5p mRNA表達對比(倍)Fig.3 miRNA-21-5p gene expression of four groups (Fold)Note: *.P<0.05.

圖4 滑膜細胞增殖率對比±s，%)Fig.4 Comparison of proliferation rate of synovial Note: *.P<0.05.

圖5 各組Bcl-2 mRNA和蛋白表達對比(倍)Fig.5 Gene and protein expressions of Bcl-2 in four groups(Fold)Note: *.P<0.05.

圖6 各組Bax mRNA和蛋白表達對比(倍)Fig.6 Gene and protein expressions of Bax in four groups (Fold)Note: *.P<0.05.

3 討論

炎性因子IL-1β通過對大鼠滑膜細胞進行誘導，使其可分泌出多種炎性介質，從而在體外建立起RA炎性細胞模型。本次研究從大鼠上分離培養原代滑膜細胞，對各組原代細胞采用IL-1β誘導的方法，研究miRNA-21-5p在整個RA發病過程中的作用機制。

目前為止大量的研究已經證實，miRNA-21-5p對調控惡性腫瘤細胞的增殖方面具有積極的意義[8-10]。RA是一種由于滑膜細胞發生異常增生從而對關節軟骨造成破壞為主要的臨床特征，并使滑膜細胞的信號傳導發生異常的疾患[11]。因此，我們推測miRNA-21-5p過表達對RA可能存在一定的保護效果。IL-1β是一種多肽類的細胞因子，其在RA的病程中具有重要的作用[12]。在體外RA研究中IL-1β可作為一種穩定的誘導劑進行使用[13]。通過本次研究發現，經過miRNA-21-5p轉染的miRNA組滑膜細胞的增殖率顯著低于Control組和BL組，此結果表明過表達miRNA-21-5p可有效抑制IL-1β所誘導的滑膜細胞增殖。同時還發現，Control組與BL組之間無明顯差異，此結果表明，在進行載體轉染過程中對細胞造成的損傷較小。為進一步闡述miRNA-21-5p在整個過程中的作用機制，我們進一步對相關蛋白和mRNA表達進行檢測。

Bcl-2和Bax與細胞凋亡增殖密切相關；若Bax表達增加時，則會形成與Bax相同源的二聚體，使細胞趨向于凋亡和抑制增殖；若Bcl-2表達過量時，則會與Bax一起形成一個異源二聚體，從而抑制凋亡促進增殖，所以當Bax表達增高，Bcl-2表達降低時，可以有效抑制細胞增殖[14，15]。在本次研究中發現，轉染后的滑膜細胞在被IL-1β誘導后，與未轉染miRNA-21-5p的滑膜細胞相比，其Bax mRNA和蛋白表達顯著增高，而Bcl-2則顯著降低，因此，推測可能是由于miRNA-21-5p的過表達，導致Bax表達增高，Bcl-2表達降低，進而使得滑膜細胞的增殖受到有效的抑制。

本次研究通過體外細胞實驗證實，miRNA-21-5p表達在控制RA疾病的進程中起到了關鍵性的作用，RA病程的發展可能與miRNA-21-5p的低表達存在一定的相關性。因此，有效提高miRNA-21-5p的表達從而促使Bax表達增高，Bcl-2表達降低，可有效控制因RA所導致的滑膜細胞異常增生，為臨床治療RA以及研制RA藥物提供了新的思路。

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[收稿2016-02-25 修回2016-03-22]

(編輯 張曉舟)

Mechanism of miRNA-21-5p on apoptosis of IL-1β-induced rat synovial cells

ZHAO Qing.

Affiliated Hospital of Henan University of Huaihe River，Kaifeng 475000,China

Objective:To investigate the role of miRNA-21-5p in the apoptosis of rat synovial cells induced by IL-1β.Methods: The synovial cells of rats were cultured in vitro and identification of type Ⅱ collagen and proteoglycan were stained by toluidine blue method;the synovial cells were divided into normal control group (NC group),control group (Control group),blank plasmid transfection group (BL group) and transfection group (miRNA group) four groups.Control,BL and miRNA three groups of cells were treated by IL-1β,the cell proliferation rate was detected by MTT,while RT-PCR and Westem blot were used to detect the expression of Bax and Bcl-2.Results: All cells were able to secrete protein polysaccharide and collagen type Ⅱ.MTT detection found that after IL-1β treatment,the cell proliferation rate of miRNA group was significantly lower than that of control group[(31.6±2.9)%vs(54.7±3.5)%],the difference was statistically significant (P<0.05);compared with the control group,Bax mRNA and protein expression levels of miRNA group were significantly lower(1.00±0.31 vs 0.75±0.15,P<0.05)，Bcl-2 mRNA and protein expression levels of miRNA group were significantly higher (2.24±1.02 vs 1.00±0.64,P<0.05).Conclusion: miRNA-21-5p can inhibit the expression of Bcl-2 and promote the expression of Bax,the protective effect of sliding mode cells induced by IL-1β.To provide a new way of thinking for the treatment of rheumatoid arthritis.

Rheumatoid arthritis;miRNA-21-5p;Bax;Bcl-2

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.008

趙 清(1974年-)，女，碩士，主要從事風濕免疫性疾病方面的研究。

R34

A

1000-484X(2016)11-1603-04