小鼠脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)前后細胞表面標記物CD3、CD4、CD44、CD62L的變化

李艷春 趙麗娜 張獻宇 喬紅梅

(吉林大學第一醫(yī)院小兒呼吸一科，長春130021)

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小鼠脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)前后細胞表面標記物CD3、CD4、CD44、CD62L的變化

李艷春 趙麗娜①張獻宇②喬紅梅③

(吉林大學第一醫(yī)院小兒呼吸一科，長春130021)

目的：探討體外培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細胞后,細胞表面標記物CD3、CD4、CD44、CD62L的變化。方法：用淋巴細胞分離液分離小鼠脾臟淋巴細胞，37℃細胞孵箱中體外培養(yǎng)3 d后，向細胞中加入流式抗體Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC，同時設陰性對照，應用流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD3、CD4、CD44、CD62L的水平。結(jié)果：小鼠脾臟淋巴細胞分離后直接做流式檢測，CD3+CD4+細胞占19.09%,其中98.61%的細胞為CD44+，68.71%為CD62L+。體外培養(yǎng)后CD3+CD4+細胞占8.96%,其中71.82%為CD44+,11.27%為CD62L+。哮喘小鼠脾臟淋巴細胞分離后直接做流式檢測，CD3+CD4+細胞占20.33%,其中97.72%的細胞為CD44+,75.74%為CD62L+。體外培養(yǎng)后CD3+CD4+細胞占7.2%,CD44陽性細胞占58.21%，CD62L陽性細胞僅占2.77%。結(jié)論：小鼠脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)后,細胞表面標記物CD44和CD62L發(fā)生巨大變化,CD62L呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢，接近消失,CD44也有下調(diào)。

表面標記物；小鼠；淋巴細胞

細胞表面存在眾多表面標記分子，可用以區(qū)分不同類型、不同功能的細胞。通過檢測細胞表面特異性標記物的表達量來評估該種類細胞的數(shù)量變化，是目前較常應用于實驗與臨床中的檢測技術。此種檢測方法多是將包含有該細胞的組織或血液采集出來后經(jīng)過多個實驗步驟制成細胞懸液，然后在流式細胞儀中檢測特定細胞表面標記物表達的相對數(shù)量。也有部分實驗是將細胞從組織或血液中分離出來，進行體外培養(yǎng)，給予干預措施后再應用流式細胞儀檢測細胞表面特異分子以鑒定特定細胞的數(shù)量變化。但培養(yǎng)基不能完全等同于細胞生活的體內(nèi)環(huán)境，細胞在體外培養(yǎng)的過程中，其表面標記物是否會由于脫離活體微環(huán)境而在表達上發(fā)生變化呢？本實驗即是帶著這樣的疑問體外培養(yǎng)了小鼠脾臟淋巴細胞，觀察其表面標記物CD3、CD4、CD44、CD62L的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物 BALB/c小鼠，18～22 g，購自吉林大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心；實驗試劑 1640 培養(yǎng)液(HyClone)，胎牛血清(Gibco)，流式抗體Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC、Rat IgG2bκPE、Rat IgG2aκ APC ，溶血素(BD biosciences公司)，淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，ConA(Sigma)；實驗儀器：菲恰爾 TDL-4A 離心機，流式細胞儀(BD 公司)；實驗器具：剪刀、鑷子、磨玻璃板、培養(yǎng)皿、15 ml 試管、200 目濾網(wǎng)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘小鼠模型構(gòu)建 選取 BALB/c 小鼠，于第0、7、14天給予 OVA+乳化氫氧化鋁混合液腹腔注射，每只小鼠注射100 μl。于第21天開始，每日給予小鼠2%OVA混懸液霧化吸入1次，每次1 h。

1.2.2 細胞分離 將小鼠脫臼處死，無菌取脾臟，用剪刀將脾臟剪成小塊，放置于磨玻璃板間研磨，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞。一部分淋巴細胞直接加入流式抗體上流式細胞儀進行檢測，另一部分淋巴細胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液、放入5%CO2、37℃細胞孵箱中進行體外培養(yǎng)。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與計數(shù) 正常小鼠淋巴細胞體外培養(yǎng)3 d(體外培養(yǎng)液中加入ConA 5 μg/ml)后，離心，棄上清，向細胞沉淀中加入適量1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，輕輕混勻。用臺盼蘭染色計數(shù)活細胞(在95%以上)，調(diào)節(jié)細胞濃度在1×107ml-1。同樣，哮喘小鼠淋巴細胞體外培養(yǎng)3 d(體外培養(yǎng)液中加入OVA 80 μg/ml)，同法培養(yǎng)、計數(shù)。

1.2.4 流式檢測 設空白管、同型對照管、實驗檢測管，每管中加入100 μl細胞懸液。空白管不加抗體；同型對照管加 CD3e-PE-CY7、CD4-FITC 和 2 個同型對照抗體 Rat IgG2bκPE、Rat IgG2bκPE；實驗檢測管加 Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC。抗體量按照說明書指示添加。加完抗體后混勻，室溫避光孵育 20 min。向各管中加入 1×溶血素1 ml，輕柔混勻，室溫避光孵育 5～10 min。待紅細胞完全裂解，離心，2 500 r/min，5 min，棄上清。每管加入1 ml PBS液洗滌2次，離心 2 500 r/min，5 min。每管加入約300 μl PBS 液，混勻細胞，上流式細胞儀檢測，

1.3 統(tǒng)計學方法 上樣后用空白管調(diào)節(jié)電壓等參數(shù)。在 CD3+CD4+的細胞群上設門，分析其中CD44、CD62L標記細胞的比例，結(jié)果用百分數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 正常小鼠檢測結(jié)果 小鼠脾臟淋巴細胞分離后直接做流式檢測，CD3、CD4、CD44、CD62L標記清晰,效應記憶T細胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-細胞占24.14%。CD3+CD4+細胞占19.09%,其中98.61%的細胞為CD44+,只有1.39%為陰性;68.71%為CD62L+,31.29%為CD62L陰性，見圖1。小鼠脾臟淋巴細胞加ConA體外培養(yǎng)3 d后檢測， CD3、CD4、CD44仍存在，CD62L標記大部分消失；CD3+CD4+細胞占8.96%,其中CD44下調(diào),71.82%為陽性,有28.18%為陰性,CD62L下調(diào)更為明顯,只有11.27%為陽性，絕大多數(shù)88.73%為陰性，見圖2。

2.2 哮喘小鼠檢測結(jié)果 哮喘小鼠脾臟淋巴細胞分離后直接做流式檢測，效應記憶T細胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-細胞占32.06%。CD3、CD4、CD44、CD62L標記清晰,CD3+CD4+細胞占20.33%,其中97.72%的細胞為CD44+,只有2.28%為陰性;75.74%為CD62L+,24.26%為CD62L-，見圖3。哮喘小鼠脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)3 d后檢測，CD3、CD4、CD44仍存在，CD62L標記幾乎完全消失， CD3+CD4+細胞占7.2%, CD44陰性細胞占41.79%,58.21%為陽性，CD62L陽性細胞僅占2.77%，見圖4。

圖1 正常小鼠脾臟淋巴細胞表面標記物CD3、CD4、CD44、CD62L的檢測Fig.1 Expression of surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on normal mouse spleen lymphocytes

圖2 正常小鼠脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)3 d后流式細胞儀檢測圖Fig.2 Expression of surface markers on normal mouse spleen lymphocytes after culture in vitro for 3 days

圖3 哮喘小鼠脾臟淋巴細胞表面標記物CD3、CD4、CD44、CD62L的檢測Fig.3 Expression of surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on asthmatic mouse spleen lymphocytes

圖4 哮喘小鼠脾臟淋巴細胞體外培養(yǎng)3 d后流式細胞儀檢測圖Fig.4 Expression of surface markers on asthmatic mouse spleen lymphocytes after culture in vitro for 3 days

3 討論

細胞表面標志包括眾多表面分子，廣泛應用于區(qū)分各類細胞及細胞亞群，CD分子是研究較多的一類細胞表面標志。CD3+CD4+淋巴細胞即CD4+T淋巴細胞，是一類重要的免疫細胞，是細胞免疫的主要應答細胞，已經(jīng)證實其在感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等多種類疾病中發(fā)揮重要作用[1-3]。

CD44是一種糖蛋白，廣泛表達于多種哺乳動物細胞表面，包括內(nèi)皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞和白細胞。CD44在細胞-細胞、細胞-基質(zhì)相互作用中具有多種重要生物學功能，包括細胞增殖、黏附、遷移、造血以及淋巴細胞的活化、歸巢等[4]。CD62L是一個重要的黏附分子，表達于靜止初始T細胞、中心型記憶T細胞和一些效應記憶T細胞表面，能夠調(diào)控白細胞向炎癥部位的遷移，調(diào)控淋巴細胞在血液與淋巴組織之間的循環(huán)[5,6]。在小鼠中，一般以 CD44的表達來界定記憶 T 細胞，即 CD44low為初始 T 細胞，CD44high為記憶 T 細胞。再用CD62L來區(qū)分中心型或是效應型記憶 T 細胞，即 CD62L+為中心型，CD62L-為效應型[7，8]。

正常小鼠由于未接觸過多的抗原刺激，其記憶T細胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-細胞的比例低，而哮喘小鼠由于經(jīng)過抗原OVA的致敏、激發(fā)，機體產(chǎn)生免疫記憶，效應型記憶T細胞比例較正常小鼠明顯升高。但細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)后，不論是正常小鼠還是哮喘小鼠，其細胞表面標記物均呈明顯下調(diào)趨勢。分析其原因：①淋巴細胞脫離活體環(huán)境后，細胞微環(huán)境發(fā)生變化，缺乏維持細胞表面標記物表達的相關因子；②雖然培養(yǎng)液中也加了相應的抗原成分，但缺乏抗原提呈細胞，淋巴細胞沒有抗原的激發(fā)較難產(chǎn)生相應的免疫反應、表達相應的表面標記物。表面標記物改變了的淋巴細胞也會改變其相應的生物學功能。Florek等[9]發(fā)現(xiàn)小鼠和人的Treg細胞冷凍后再融化，其細胞表面CD62L的表達會下降，而且這樣的Treg細胞在移植物抗宿主疾病中的保護作用也會降低。這與我們的實驗結(jié)果相一致，淋巴細胞體外放置或培養(yǎng)后，表面標記物會自然變化，對于CD44和CD62L來說，即是出現(xiàn)表達下降，其他表面標記物會發(fā)生怎樣的變化，還需要進一步來研究與證實。因此，在體外條件下培養(yǎng)細胞，并擬行表面標記物檢測實驗時，需充分考慮到該表面標記物可能會自然下降的因素。

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[收稿2016-06-12 修回2016-06-23]

(編輯 倪 鵬)

Changes of cell surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on mouse spleen lymphocytes after culture in vitro

LI Yan-Chun,ZHAO Li-Na,ZHANG Xian-Yu,QIAO Hong-Mei.

Pediatric Respiratory Department,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To study the changes of cell surface markers CD3,CD4,CD44 and CD62L on mouse spleen lymphocytes after culture in vitro.Methods: Spleen cells were separated from BALB/c mice and asthmatic mice and lymphocytes were isolated by using lymphocyte separation liquid.We cultured lymphocytes with RPMI1640 medium(10% FBS) in cell incubator for 3 days.Then the four cell surface markers were detected by using flow cytometry.Results: In normal mice,19.09% of lymphocytes stained positively for CD3 and CD4,among these cells 98.61% was CD44+T cell and 68.71% was CD62L+T cell before the culture.After culture with ConA for 3 days,CD3+CD4+and CD3+CD4+CD44+T cell population was down regulated to 8.96% and 71.82%,respectively.While CD62L almost disappeared,accounting for 11.27% only.For asthmatic mice,CD3+CD4+T cell accounted for 20.33% in total lymphocytes,among which 97.72% was CD44+and 75.74% was CD62L+before the culture.After culture,CD3+CD4+T cell accounted for 7.2%,among which CD44+only 58.21% and CD62L+only 2.77%.Conclusion: In both normal and asthmatic mice,CD3,CD4,CD44 and CD62L on spleen lymphocytes were down regulated after culture in vitro regardless with or without stimulating factors,especially CD62L,almost disappeared.This should be given full consideration when these markers are detected after cell culture.

Cell surface marker;Mouse;Lymphocyte

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.009

李艷春(1980年-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事支氣管哮喘的發(fā)病機制與治療新策略方面研究。

R392.12

A

1000-484X(2016)11-1607-03

①吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院甲狀腺外科，長春130033。

②吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院手足外科，長春130033。

③通訊作者，E-mail：2670132366@qq.com。