高麗參提取液對大鼠自身免疫性腦脊髓膜炎的保護作用①

龔業莉 李佳楠 黃麗霞

(江漢大學，武漢430056 )

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高麗參提取液對大鼠自身免疫性腦脊髓膜炎的保護作用①

龔業莉 李佳楠 黃麗霞②

(江漢大學，武漢430056 )

目的：探討高麗參提取液(Korean red ginseng extract，KRG)對實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)的治療作用及相關免疫調節機制。方法：取SD大鼠30只，隨機分為空白對照組、模型組(實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型)和實驗組(高麗參提取液治療)，每組10只，對EAE大鼠進行神經功能評分及體重測量，通過病理學HE染色和免疫組化觀察25 d腦和脊髓炎癥浸潤，流式細胞術檢測大鼠脊髓和淋巴結CD4+、CD4+/IFN-γ+(Th1)、CD4+/IL-17+(Th17)和CD4+/Foxp3+T細胞數量，實時熒光定量q-PCR檢測大鼠脊髓和淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA水平的表達。結果：治療組大鼠神經功能評分明顯改善，體重明顯增加；與模型組比較，實驗組神經癥狀和病理改變減輕；與模型組相比，治療組中大鼠脊髓和淋巴結CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+T細胞數量減少，而CD4+/Foxp3+T細胞數量增多(P<0.05)；大鼠脊髓和淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達下降，而Foxp3 mRNA表達增加(P<0.05)。結論：高麗參提取液通過調節免疫系統的CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+T細胞數量和CD4+T細胞分泌細胞因子的水平對EAE起保護作用。

高麗參提取液；自身免疫性腦脊髓膜炎；白介素-17；白介素-23

實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelintis， EAE)是一種主要由T細胞介導的，以中樞神經系統(Central nervous system,CNS)脫髓鞘以及炎癥浸潤為主要特征的自身免疫性疾病。目前關于EAE發病機制并不明確，也缺乏理想藥物進行治療。研究發現，高麗參提取液(Korean red ginseng extract，KRG)在預防糖尿病以及動脈硬化、高血壓等方面具有明顯的效果，此外，高麗參還具有促進血液循環，防止疲勞，增強免疫力以及抗癌等方面的療效[1-3]。近年來也有研究表明，高麗參提取液對神經系統也具有保護作用[4，5]。本研究采用豚鼠全脊髓勻漿制備大鼠EAE模型，探討高麗參提取液對EAE的作用，并觀察大鼠行為學變化和CNS的病理學改變，試圖為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 大鼠30只，雌性，6～8周，150～200 g。豚鼠6只，雌雄不拘，250～300 g，均由華中科技大學動物實驗中心提供。

1.1.2 材料和試劑 高麗參提取液，濃度為1 ml含生藥3 g，湖北中醫藥大學藥學院提供。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)多肽片段由聯美生物科技有限公司合成；結核菌素、百日咳毒素(Difco公司，美國)；完全弗氏佐劑(Sigma公司，美國)；Real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)；熒光團標記的抗小鼠單克隆抗體(mAb)：APC-CD4、FITC-IFN-γ、PE-IL-17、APC-Foxp3及同型對照均購自eBiosciences公司。ABI 7500 PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 30只SD大鼠隨機分為3組：正常組，模型組和實驗組(每組10只)，實驗組與模型組：實驗組大鼠分別于背側中線兩側皮下四點髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)與完全弗氏佐劑(CFA)混合的乳化抗原(100 μg/只)，免疫當天及第2天給小鼠皮下注射百日咳疫苗(BPV)0.1 ml(含菌量為1010個/ml)。正常組：大鼠腳墊皮內注射CFA和0.9%NaCl溶液制成的乳劑，注射部位和劑量同模型組。實驗組在免疫前，灌胃高麗參提取液50 mg/kg，連續給予7 d預處理；模型組和正常對照組在造模前用等量的0.9%NaCl溶液灌胃7 d預處理。免疫當日計算為0 d。

1.2.2 臨床EAE癥狀評分 從免疫當天起，每天對大鼠進行稱重，并對其精神狀況和活動情況等行為學指征進行觀察，并進行評分，評分標準采用國際通用的Correar 6分[6]評分法：無明顯異常為0分，大鼠擺尾無力為1分，后肢無力為2分，后肢癱瘓3分，前、后肢全癱瘓4分，瀕死狀態或死亡5分。將評分≥1分視為EAE發病大鼠。

1.2.3 組織學檢測 大鼠稱重后，腹腔注射10%的水合氯醛4 ml/kg。麻醉后，固定于解剖板上，備皮，消毒，迅速取出腦組織和腰髓節段。中性福爾馬林緩沖溶液固定72 h，分別取腦干及腰髓節段石蠟切片，然后進行HE染色。并根據文獻[7]進行組織學評分。

1.2.4 流式細胞儀檢測CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+T細胞表達 25 d處死各組大鼠，無菌條件下分別獲取大鼠脊髓和淋巴結，通過機械研磨、裂解紅細胞后，PBS洗3次，制成單個核細胞懸液。加入APC-CD4、FITC-IFN-γ、PE-IL-17、APC-Foxp3 抗大鼠mAb及同型對照抗體三標記細胞，利用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 Real-time PCR(q-PCR)檢測IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA表達 25 d提取各組大鼠脊髓和淋巴結，加入Trizol 試劑提取總RNA，用Real-time PCR Kit(TaKaRa 公司)逆轉錄成cDNA，利用SYBR green Ⅰ Real-time PCR Kit(TaKaRa 公司)試劑盒擴增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，GAPDH作為內參。各基因引物序列見表1。

2 結果

2.1 臨床EAE癥狀評分 體重方面，空白對照組至25 d體重持續增長，皮毛光滑，未見異常。模型組和實驗組大鼠體重均有不同程度下降，起病8 d明顯下降，進食少，活動少，皮毛粗糙，至第15天體重達最低點，而后體重逐漸增長，實驗組較模型組體重下降程度輕，實驗組與模型組免疫后8～25 d體重變化差異均有統計學意義(P<0.05)。神經功能評分方面，空白對照組平均評分為0分，模型組大鼠在免疫后第6天開始發病，至第14天達到高峰，表現為雙下肢癱瘓，肌力下降，二便失禁；實驗組大鼠表現為相對緩慢的起病過程，臨床癥狀也相對較輕，實驗組與模型組免疫后6～25 d神經功能評分差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1，各組大鼠發病和轉歸情況見表2。

2.2 組織學變化 HE染色顯示，對照組大鼠腦和脊髓未發現炎癥浸潤，而模型組大鼠腦和脊髓均有不同程度的炎癥浸潤，以血管周圍為主，尤其靜脈周圍明顯，呈“袖套狀”變化，病癥多發性，炎癥細胞浸潤以腦干最明顯，脊髓次之。實驗組較模型組腦和脊髓炎癥浸潤顯著減輕，其病灶數和“袖套狀”均顯著低于模型組。組織學評分，與模型組腦和脊髓組織學評分分別為(3.96±0.93)和(3.06±0.81)，實驗組腦和脊髓組織學評分分別為(2.59±0.49)和(1.88±0.57)。與模型組比較，實驗組在腦和脊髓的炎癥細胞浸潤明顯下降，差異具有統計學意義(t=13.696，P=0.000；t=10.483，P=0.000)。見圖2。

表1 各基因引物序列

Tab.1 Primer sequences for target genes

TargetgenesPrimersequencesIFN?γUpstreamGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACDownstreamGCAGCGACTCCTTTTCCGCTTCCTIL?17UpstreamCTCAGACTACCTCAACCGTTCCDownstreamAGGATCTCTTGCTGGATGAGAACIL?23UpstreamGACCTGCTGGCAATAGCTTCDownstreamGGGTCTCCCAAGGAAAGGTAFoxp3UpstreamTGCATCAGCTCTCCACTGTADownstreamCTGTCTTTCCTGGGTGTACCTGAGCGGAPDHUpstreamAGGTCATCCCAGAGCTGAACGDownstreamCACCCTGTTGCTGTAGCCGTAT

2.3 各組大鼠脊髓及淋巴結CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+T細胞表達 流式細胞儀檢測結果顯示，第25天，與正常對照組比較，模型組大鼠脊髓和淋巴結CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+T細胞數量上調，而CD4+/Foxp3+T細胞數量減少(P<0.05)。與模型組相比，實驗組中大鼠脊髓和淋巴結CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+T細胞數量減少，而CD4+/Foxp3+T細胞數量增多(P<0.05)。見圖3。

圖1 免疫后各組大鼠平均體重和癥狀評分變化Fig.1 Changes of average weight and symptom scoring after immunizationNote: *.P<0.05,vs control group；#.P<0.05,vs model group.

圖2 大鼠腦及脊髓組織學觀察(HE，×200)Fig.2 HE staining of brain and spinal cord(HE×200)Note: A.Control group of the brain；B.Model group of the brain;C.Test group of the brain;D.Control group of the spinal cord；E.Model group of the spinal cord;F.Test group of the spinal cord.

表2 各組動物發病和轉歸情況

Tab.2 Incidence and prognosis of rats in all groups

GroupsNumberIncidenceLatency(d)MortalityControlgroup100/1000±000/10Modelgroup1010/1067±071)0/10Testgroup1010/1078±062)0/10

Note：1)P<0.05,vs control group,2)P<0.05,vs model group.

2.4 各組大鼠脊髓及淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA表達 q-PCR結果顯示，第25天，與正常對照組比較，模型組脊髓和淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達上調，Foxp3 mRNA表達增高(P<0.05)。而與模型組相比，實驗組大鼠脊髓和淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達下降，而Foxp3 mRNA表達增加(P<0.05)。見圖4。

圖3 各組大鼠脊髓及淋巴結CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+ T細胞表達Fig.3 Expression of CD4+，CD4+/IFN-γ+，CD4+/IL-17+ and CD4+/Foxp3+ T cells in spinal cord and lymph nodeNote: *.P<0.05，vs control group；#.P<0.05，vs model group

圖4 各組大鼠脊髓及淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA表達Fig.4 mRNA expression of IFN-γ，IL-17，IL-23 and Foxp3 in spinal cord and lymph nodeNote: *.P<0.05，vs control group；#.P<0.05，vs model group.

3 討論

EAE中樞神經系統脫髓鞘病變與效應性T細胞過度活化以及炎癥細胞在CNS中過度浸潤相關，也與炎癥細胞因子和介質的高表達密切相關。本實驗通過MOG成功誘導大鼠建立的EAE模型，行為學上表現為發病期行動遲緩，步態異常，體重下降，尾巴及肢體癱瘓；病理見腦干以及脊髓炎性細胞浸潤和血管“袖套”樣改變等，驗證了文獻報道[8]，經KRG預處理后，實驗組大鼠體重及癥狀評分明顯改善，且腦干以及脊髓炎性細胞浸潤和血管“袖套”樣改變也得到明顯減輕，炎癥細胞數量明顯下調，提示KRG可通過抑制CNS中炎性反應從而發揮神經保護作用。

大多數研究認為在EAE的免疫機制中，特異性抗原如MBP誘導CD4+T細胞發生免疫應答，CD4+Th細胞由Th0向Th1、Th2或Th3細胞分化[9,10]。Th1細胞分泌的IFN-γ以及Th17細胞分泌IL-17和IL-23，促進細胞介導的免疫應答，誘導EAE；而Th2細胞主要有IL-4所驅動誘發，主要分泌IL4、IL-10、TGF-13等，促進B細胞增生，增強抗體介導的體液免疫，抑制EAE[11]。IL-17能夠刺激多種細胞，誘發炎性細胞分泌細胞因子及化學因子等，IL-17主要由活化的T細胞產生，其致炎性較強，缺失Th17的細胞能夠顯著緩解一些自身免疫疾病的發生，如EAE等[12]。研究發現，EAE大鼠模型中，IL-17高峰的出現較IFN-γ早；但IFN-γ高峰持續時間較IL-17長，提示Th1及Th17的分化表達的一個主要特點就是階段性[13]。EAE大鼠早期CNS的發病中Th17細胞發揮著至關重要的作用，而后期組織炎癥反應中Th1細胞發揮著至關重要的主導作用[14,15]；本實驗中，通過KRG預處理后，EAE大鼠CD4+、CD4+/IFN-γ+(Th1)、CD4+/IL-17+(Th17)T細胞數量減少，而CD4+/Foxp3+T細胞數量增多。為了從分子水平驗證以上結果，我們通過實時熒光定量PCR檢測IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA的表達水平，結果發現，與正常對照組比較，模型組脊髓和淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達上調，Foxp3 mRNA表達增高，與文獻報道相一致[16]。而與模型組相比，大鼠脊髓和淋巴結IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達下降，而Foxp3 mRNA表達增加。綜上可知，KRG可通過下調IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達抑制CD4+/IFN-γ+(Th1)、CD4+/IL-17+(Th17)T細胞的表達，而通過上調Foxp3 mRNA表達增強CD4+/Foxp3+T細胞表達，提示KRG可通過上調Treg數量，調節Th1/Th17細胞比例，從而增強其免疫抑制活性，影響EAE進展，改善實驗動物的臨床相關癥狀。

綜上所述，高麗參提取液可通過對Th1、Th17、Foxp3基因以及相關細胞因子進行調節，有效降低大鼠EAE的臨床癥狀，改善神經中樞系統的炎癥浸潤，從而發揮神經保護作用。

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[收稿2016-03-24 修回2016-04-28]

(編輯 許四平)

Protective effect of korean red ginseng extract in experimental autoimmune encephalomyelitis rats

GONG Ye-Li ,LI Jia-Nan,HUANG Li-Xia，

Jianghan University，Wuhan 430056 China

Objective:To establish experimental autoimmune cerebral spinal cord inflammation (EAE) model rats,and observe the pathological changes and effect of korean red ginseng extract on EAE model. Methods: 30 SD rats were randomly divided into control group,EAE (model group) group and KRG group.The EAR symptom score and body weight were used to evaluate the rats after the model.The inflammation of the brain and spinal cord demyelinating changes were observed by HE staining.The frequency of CD4+,CD4+/IFN-γ+,CD4+/IL-17+and CD4+/Foxp3+T cells were measured by flow cytometry,and the expression of Foxp3,IFN-γ,IL-17 and IL-23 mRNA were evaluated by Real time-PCR in spinal cord and lymph node. Results: KRGE significantly attenuated symptom score and loss of body weight.Compared with model group,neurological impairment and pathological change were alleviated in KRG group.The number of CD4+,CD4+/IFN-γ+,CD4+/IL-17+were down-regulated in KRG,and the number of CD4+/Foxp3+was up-regulated in the spinal cord and lymph node compared with the model group(P<0.05).The levels of Foxp3 mRNA was also significantly increased,while the levels of IFN-γ，IL-17，IL-23 mRNA were markedly decreased(P<0.05). Conclusion: KRG could have an effect on prevention on EAE in SD rats,may be related to its ability to the regulations the expression levels of CD4+,CD4+/IFN-γ+,CD4+/IL-17+and CD4+/Foxp3+.

Korean red ginseng extract;Experimental autoimmune encephalomyelitis;Interleukin-17;Interleukin-23

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.014

①本文受國家自然科學基金青年項目(81302528)和武漢市青年科技晨光計劃項目(2015071704011601)資助。

龔業莉(1985年-)，女，博士，講師，主要從事自身免疫病研究，E-mail：lilygreen66@163.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)11-1632-04

②通訊作者，E-mail：hlxgw2011@163.com。