IFN-β對沙眼衣原體感染的影響①

杜 昆 李 琦

(湖北省荊州市第一人民醫院檢驗科，荊州434000)

?

IFN-β對沙眼衣原體感染的影響①

杜 昆 李 琦②

(湖北省荊州市第一人民醫院檢驗科，荊州434000)

目的：研究IFN-β在沙眼衣原體感染細胞中的表達及其對衣原體感染的影響。方法：采用ELISA雙抗體夾心法檢測衣原體感染細胞培養上清中IFN-β的表達，利用抗人IFN-β抗體中和IFN-β的作用，然后分別用Western blot和免疫熒光技術檢測沙眼衣原體感染后衣原體主要外膜蛋白、STAT1蛋白、p-STAT1蛋白和衣原體二次感染滴度變化。結果：沙眼衣原體能誘導宿主細胞表達IFN-β、STAT1蛋白和p-STAT1蛋白，抑制IFN-β的作用能下調STAT1和p-STAT1蛋白表達，同時促進衣原體生長和提高衣原體的二次感染滴度。結論：沙眼衣原體感染能通過誘導宿主細胞分泌IFN-β并上調和活化STAT1蛋白而抑制衣原體生長。

沙眼衣原體；β干擾素；感染

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是一種嚴格細胞內寄生的病原菌，可引起人類多種疾病，是沙眼和性傳播性疾病的常見病原體，還可導致異位妊娠、早產、不孕等并發癥[1-3]。此外，Ct與HIV的感染和腫瘤的發病也有著密切的關系[4-6]。Ct感染人體后，可逃避機體的免疫應答，造成持續性感染。因此，研究機體抗Ct感染的免疫機制具有重要的臨床意義。干擾素具有抑制胞內病原微生物感染和復制的作用，主要包括Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和Ⅱ型干擾素(IFN-γ)。IFN-γ對Ct生長的影響報道較多[7-9]，而IFN-β在Ct感染過程中的作用報道較少。本課題旨在探討IFN-β在Ct感染細胞中的表達及其對Ct生長的影響，為防治Ct感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 沙眼衣原體L2血清型和HeLa細胞均由中南大學余平教授惠贈；DMEM培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；人IFN-β ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；放線菌酮購自Invitrogen公司；兔抗人IFN-β、STAT1和p-STAT1抗體、羊抗MOMP抗體購自Santa Cruz公司；HRP標記的二抗購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和Ct增殖 將HeLa細胞接種到50 cm2細胞培養瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2的培養箱中培養，細胞長成75%融合后，棄培養基，加衣原體懸液，2 h后棄上清，加生長液(含10%胎牛血清和2 mg/L放線菌酮)繼續培養，48 h后收集細胞并重懸細胞沉淀，37℃水浴與-80℃反復凍融3次，1 000 r/min離心8 min，上清即為衣原體懸液，分裝后-80℃保存備用。

1.2.2 Ct感染 按方法1.2.1培養細胞，然后按照不同實驗要求加入不同量的Ct懸液，同時加入或不加入100 μg/ml青霉素或60 μg/ml氯霉素，于不同時間點吸取上清，試劑盒檢測上清IFN-β含量。

1.2.3 ELISA雙抗體夾心法檢測IFN-β 用人IFN-β ELISA試劑盒檢測IFN-β。步驟如下：將標準品、待測樣本各100 μl加入到預先包被有人IFN-β多克隆抗體的酶標板中，37℃孵育1 h，洗滌5次，每次1 min；加入酶標二抗100 μl，37℃孵育1 h，洗滌5次，每次1 min；加入底物A、B，37℃避光孵育30 min，加終止液50 μl終止反應，450 nm波長下測定各孔OD值，根據標準品OD值制備標準曲線，根據標準曲線和待測樣本OD值計算待測樣本中人IFN-β含量。

1.2.4 Western blot實驗 在6孔板中制備單層HeLa細胞，加入抗人IFN-β抗體，然后加入衣原體懸液，培養48 h后提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度，以每孔 80 μg樣本上樣電泳，轉膜；室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3次，每次5 min，加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min，室溫孵育HRP標記的二抗2 h，ECL發光試劑盒檢測蛋白條帶。

1.2.5 Ct二次感染滴度的測定 按文獻[10]測定Ct二次感染滴度，主要步驟如下：在培養的單層HeLa細胞中加入抗人IFN-β抗體和衣原體懸液，感染48 h后收集衣原體；將收集的衣原體作系列稀釋后接種到預先放有玻片的24孔板HeLa細胞中，每個稀釋度設3個復孔；感染48 h后取出玻片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%曲拉通透化4 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，羊抗MOMP抗體4℃孵育過夜，FITC標記的二抗室溫孵育1 h，封片，鏡下觀察。高倍鏡下隨機取5個視野共200個細胞進行包涵體記數，計算每孔平均包涵體數(IFU)及Ct原液中Ct濃度(IFU/ml=平均每孔包涵體數×稀釋倍數/Ct接種量)。

2 結果

2.1 Ct感染細胞IFN-β表達上調 Ct感染細胞后，于不同時間點檢測IFN-β。結果如圖1所示，感染0 h IFN-β表達量較低，為6.89 pg/ml；而感染后6、12、24、36和48 h IFN-β表達量分別為46.32、98.51、139.65、201.21和226.78 pg/ml，呈現出隨著感染時間延長，IFN-β表達量逐漸增多，且與0 h比較，IFN-β表達變化均具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 Ct的生長促進IFN-β表達 圖2A所示，未感染Ct細胞 (0 h) IFN-β表達量較低，為7.06 pg/ml；而0.5、1.0、 1.5和3.0 MOI感染細胞IFN-β表達量分別為58.97、89.78、128.79和198.65 pg/ml，與未感染細胞比較，IFN-β表達變化均具有統計學意義(P<0.05)。圖2B所示，Ct感染細胞IFN-β表達量為216.38 pg/ml，在青霉素作用下的Ct感染細胞IFN-β表達量為205.68 pg/ml，二者比較，IFN-β表達變化無統計學意義(P>0.05)；而在氯霉素作用下的Ct感染細胞IFN-β表達量為20.21 pg/ml，與單純Ct感染細胞比較，IFN-β表達變化有統計學意義(P<0.05)。

2.3 加入抗IFN-β抗體促進衣原體生長 圖3A所示，Ct感染細胞可檢測到MOMP蛋白表達(第2道)，加入抗IFN-β抗體后，MOMP蛋白表達量明顯增多(第3道)。圖3B所示，未加抗IFN-β抗體時，Ct二次感染滴度為6.8 IFU/ml(log10)，而分別加入5、10和20 μg/ml抗IFN-β抗體時，Ct二次感染滴度為8、10.1和12.3 IFU/ml(log10)，與未加抗IFN-β抗體感染細胞比較，Ct二次感染滴度變化有統計學意義(P<0.05)。

圖1 Ct感染HeLa細胞IFN-β表達Fig.1 Expression of IFN-β in Ct-infected HeLa cells

圖2 Ct的生長促進IFN-β表達Fig.2 Ct growth promote expression of IFN-β

圖3 抗IFN-β抗體促進衣原體生長Fig.3 Anti-IFN-β antibody promote Ct growth

圖4 抑制STAT1蛋白表達與活化促進衣原體生長Fig.4 Inhibition of STAT1 expression and activity promote Ct growth

2.4 Ct感染細胞通過誘導IFN-β分泌上調并活化STAT1蛋白 圖4所示，與正常細胞對照組相比，Ct感染細胞STAT1和p-STAT1蛋白表達明顯上調(第2道)，加入抗IFN-β抗體后，STAT1和p-STAT1蛋白表達量明顯減少，同時MOMP蛋白表達量明顯增多(第3道)。外源性IFN-β單獨作用于HeLa細胞，STAT1和p-STAT1蛋白表達也明顯增多(第4道)。

3 討論

衣原體感染可誘導宿主發生免疫應答，主要以巨噬細胞和T細胞介導的細胞免疫為主。致敏的CD4+T細胞能釋放多種細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-10[11，12]，同時能激活巨噬細胞，從而抑制衣原體的增殖。其中IFN-γ是機體抗衣原體感染的一個重要的細胞因子，它可以通過誘導宿主細胞產生NO[9]，而NO作為一種免疫效應分子可介導細胞毒作用而抑制或殺死細胞內寄生物。有文獻報道，Ct感染后也可誘導宿主細胞產生IFN-β[13，14]，但IFN-β在宿主防御Ct感染中的作用并不十分清楚。

本研究中，我們利用Ct L2血清型感染HeLa細胞，ELISA雙抗體夾心法檢測Ct感染細胞培養上清中是否含有IFN-β。結果證實，Ct感染不但能誘導宿主細胞產生IFN-β，并且隨著感染時間的延長，IFN-β表達量也逐漸增多，表明Ct感染能誘導宿主細胞表達IFN-β。為進一步證實Ct的生長與IFN-β表達的關系，我們用不同劑量的Ct感染細胞，結果表明隨著感染劑量的增加，IFN-β的表達也逐漸增多；此外，我們進一步用100 μg/ml青霉素和60 μg/ml氯霉素的作用于Ct感染細胞，然后檢測IFN-β表達，結果證實青霉素并不影響Ct感染細胞IFN-β的表達，而氯霉素能明顯減少感染細胞IFN-β的表達。雖然青霉素能抑制衣原體RB復制和RB向EB的轉化，但不影響衣原體蛋白合成，而氯霉素能抑制衣原體蛋白合成，表明IFN-β表達依賴于Ct生長。

為研究IFN-β對Ct生長的影響，我們事先在Ct感染之前加入抗人IFN-β抗體，以中和Ct感染誘導產生的IFN-β作用，然后用兩個不同的實驗證實IFN-β對Ct的生長影響。首先，我們檢測當IFN-β作用被抗體中和后MOMP表達情況，因為MOMP是衣原體菌體蛋白，能很好反映Ct的生長情況，結果表明當IFN-β作用被抗體中和后，MOMP蛋白的表達量增多；其次，通過檢測Ct的二次感染滴度，進一步證實了IFN-β作用被抗體中和后對Ct活性的影響，結果表明隨著抗人IFN-β抗體濃度的逐漸增加，Ct二次感染滴度也逐漸升高，未加抗人IFN-β抗體時，其感染滴度最低，結果證實IFN-β具有抑制體外Ct生長的作用。由于IFN-β可以影響細胞多個基因表達，如IFN-β可以上調人成纖維細胞STAT1、STAT2和IRF9蛋白表達[15]。Lad等[14]報道衣原體感染細胞能通過上調STAT1蛋白表達而抑制衣原體生長，而有活性的STAT1蛋白以磷酸化形式存在。為證實IFN-β對Ct生長抑制作用是否與STAT1和p-STAT1蛋白表達有關，我們檢測了沙眼衣原體感染細胞STAT1 和p-STAT1蛋白表達情況。結果發現Ct感染細胞STAT1和 p-STAT1蛋白表達明顯上調，加入抗IFN-β抗體后，STAT1和 p-STAT1蛋白表達量明顯減少，同時MOMP蛋白表達量明顯增多。外源性IFN-β單獨作用于HeLa細胞，STAT1和 p-STAT1蛋白表達也明顯增多。以上研究結果表明，沙眼衣原體感染細胞可能主要通過誘導IFN-β分泌并上調和活化STAT1蛋白而抑制衣原體生長。

綜上所述，Ct感染細胞不但能表達IFN-β，而且能通過IFN-β誘導STAT1蛋白表達而抑制Ct的增殖，這可能是宿主細胞防御Ct感染的機制之一。

[1] Ohman H,Bailey R,Natividad A,etal.Effect of IL12A and IL12B polymorphisms on the risk of Chlamydia trachomatis-induced tubal factor infertility and disease severity [J].Hum Reprod,2012,27(7):2217-2223.

[2] Rours GI,Duijts L,Moll HA,etal.Chlamydia trachomatis infection during pregnancy associated with preterm delivery a population-based prospective cohort study [J].Eur J Epidemiol,2011,26(6):493-502.

[3] EI Hakim EA,Gordon UD,Akande VA.The relationship between serum Chlamydia antibody levels and severity of disease in infertile women with tubal damage [J].Arch Gynecol Obstet,2010,281(4):727-733.

[4] Henning T,Butler K,Hanson D,etal.Increased susceptibility to vaginal SHIV transmission in pigtail macaques coinfected with Chlamydia trachomatis and trichomonas vaginalis [J].J Infect Dis,2014,210(8):1239-1247.

[5] Jensen KE,Thomsen LT,Schmiedel S,etal.Chlamydia trachomatis and risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 or worse in women with persistent human papillomavirus infection:a cohort study [J].Sex Transm Infect,2014,90(7):550-555.

[6] Silva J,Cerqueira F,Medeiros R.Chlamydia trachomatis infection:implications for HPV status and cervical cancer [J].Arch Gynecol Obstet,2014,289(4):715-723.

[7] Jerchel S,Kaufhold I,Schuchardt L,etal.Host immune responses after hypoxic reactivation of IFN-γ induced persistent Chlamydia trachomatis infection [J].Front Cell Infect Microbiol,2014,4(43):1-7.

[8] 布曉坤,李宏釗,邢冬紅,等.IFN-γ在沙眼衣原體呼吸道感染中免疫防御機制的探討[J].中國免疫學雜志,2007,23(12):1129-1132.

[9] 王 潔,余 平,查國章,等.IFN-γ對沙眼衣原體感染細胞的細胞毒作用及其機制[J].中華微生物學和免疫學雜志,2002,22(5):526-529.

[10] 杜 昆,王芙艷,霍 治,等.沙眼衣原體生長依賴MEK/ERK信號通路的激活[J].生命科學研究,2010,14(5):424-426.

[11] Lu H,Yang X,Takeda K,etal.Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis lung infection in IL2-18 and IL-12 knockout mice:IL-12 is dominant over IL-18 for protective immunity [J].Mol Med,2000,6(7):604-612.

[12] Christine R,Heidi W,Harlan DC,etal.Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells [J].Infect Immun,2006,74(1):225-238.

[13] Devitt A,Lund PA,Morris AG,etal.Induction of alpha/beta interferon and dependent nitric oxide synthesis during Chlamydia trachomatis infection of McCoy cells in the absence of exogenous cytokine [J].Infect Immun,1996,64(10):3951-3956.

[14] Lad SP,Fukuda EY,Li J,etal.Up-Regulation of the JAK/STAT1 signal pathway during Chlamydia trachomatis infection [J].J Immunol,2005,174(11):7186-7193.

[15] Cheon H,Holvey-Bates EG,Schoggins JW,etal.IFNβ-dependent increases in STAT1, STAT2,and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage [J].EMBO J,2013,32(20):2751-2763.

[收稿2016-01-12 修回2016-02-12]

(編輯 許四平)

Effect of IFN-β on Chlamydia trachomatis infection

DU Kun, LI Qi.

Department of Clinical Laboratory,the First People′s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China

Objective:To investigate the expression of IFN-β in Chlamydia trachomatis-infected cells and the effect of IFN-β on Chlamydia trachomatis infection. Methods: IFN-β was examined in Chlamydia trachomatis-infected cells culture supernatant with ELISA double antibody sandwich method.Chlamydia trachomatis major outer membrane protein,STAT1 protein and p-STAT1 and infectious titers were detected by using Western blot and immunofluorescence assays,respectively,after the IFN-β was neutralized by IFN-β antibody. Results: Chlamydia trachomatis infection could induce IFN-β and STAT1 protein and p-STAT1 expression.Inhibition the activity of IFN-β could down-regulated the expression of STAT1 and p-STAT1 protein,moreover,promotes Chlamydia trachomatis growth and secondary infectious titers.Conclusion: Chlamydia trachomatis growth were inhibited by IFN-β in a STAT1-dependent fashion in infected cells.

Chlamydia trachomatis;IFN-β;Infection

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.020

杜 昆(1972年-)，男，博士，副主任技師，主要從事抗感染免疫方面的研究。

R374+1

A

1000-484X(2016)11-1657-04

①本文為湖北省衛生廳青年科技人才項目(QJX 2012-46)。

②通訊作者，E-mail: liqijzhyy@163.com。