血液凈化對膿毒癥患者凝血功能及免疫功能的影響①

李 軍 張鋒利 吐爾滾·艾沙 吳 燕 李 超

(新疆兵團第一師醫院重癥醫學科，阿克蘇843000)

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血液凈化對膿毒癥患者凝血功能及免疫功能的影響①

李 軍 張鋒利②吐爾滾·艾沙 吳 燕 李 超③

(新疆兵團第一師醫院重癥醫學科，阿克蘇843000)

目的：探究連續性血液凈化 (Continuous blood purification，CBP) 對膿毒癥患者凝血功能及免疫功能的影響。 方法：選取2012年1月至2015年1月入住新疆兵團第一師醫院重癥監護病房54例符合膿毒癥診斷標準的患者納入本研究。采取CBP治療，分別在治療前、治療后12、24、48、72 h時，對患者持續性觀察，測定其APACHEⅡ評分。收集患者不同CBP治療時間段的血液，利用流式細胞儀檢測外周血免疫細胞CD4+/CD8+，ELISA法檢測其分泌的細胞因子IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α，凝固法檢測其凝血功能指標PT、APTT、TT，免疫比濁法檢測FIB。 結果：膿毒癥患者治療前PT、APTT、TT和FIB含量高于健康人群，具有統計學意義 (均P<0.05) 。CBP治療12、24、48、72 h的凝血功能指標PT、APTT、TT、FIB相比CBP治療前顯著降低 (P<0.05)。膿毒癥患者組的CD3+、CD4+和CD4+/CD8+細胞頻率較健康組明顯降低 (均P<0.05)。CBP治療12、24、48、72 h，相比治療前，CD3+T、CD4+T細胞頻率逐漸升高 (均P<0.05)。CBP治療12、24、48、72 h的CD4+/CD8+比例比治療前顯著升高 (均P<0.05)。治療前、CBP治療12、24、48 h的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+細胞頻率低于健康組 (均P<0.05) 。CBP治療12、24、48、72 h的IL-1、IL-6、IL-10的水平較治療前降低 (均P<0.05)。CBP治療48 h、72 h的TNF-α的水平較治療前顯著降低 (均P<0.05)。治療前、CBP治療12、24、48 h的IL-1的水平高于健康組 (均P<0.05)。治療前、CBP治療12、24、48、72 h的IL-6、IL-10的水平高于健康組 (均P<0.05)。治療前、CBP治療12、24 h的TNF-α水平顯著高于健康組 (均P<0.05)。CBP治療12、24、48、72 h的APACHEⅡ評分與治療前比較均顯著降低 (均P<0.05)。 結論：連續性血液凈化能夠通過清除血液中炎癥因子，增強機體免疫功能，對改善膿血癥患者的病情有一定幫助。

連續性血液凈化；膿毒癥；凝血功能；細胞因子；CD4+/CD8+；APACHEⅡ評分；白介素；外周血T淋巴細胞

膿毒癥 (Sepsis) 主要是由腦膜炎、肺炎、泌尿系統等感染導致的全身炎癥反應綜合征[1]。據報道：每年的膿毒癥患者在全球大約有750 000萬例，死亡為225 000例。我國膿毒癥的死亡率45%～70%，其發病急、病情進展迅速、病死率每年還在不斷升高[2,3]。膿毒癥發病機制涉及免疫、凝血、炎癥、感染以及機體各系統、各器官的病理生理變化[4,5]。其中，凝血功能失控和免疫功能紊亂是膿毒癥發生和發展的中心環節，膿毒癥時免疫反應的炎癥因子和凝血因子相互作用，相互促進膿毒癥的進展和惡化[6]。膿毒癥的早期階段，血液中產生大量的細菌，同時釋放出內毒素，從而誘導機體免疫系統分泌大量的炎癥因子和促炎介質，以及氧自由基和血管活性物質[7，8]。炎癥系統中的炎癥因子和促炎介質可激活凝血系統的凝血因子，抑制抗凝機制、造成血液高凝狀態、形成血栓、導致微血管栓塞，最后導致患者發生嚴重膿毒癥或膿毒癥休克[9-11]。

目前，膿毒癥的治療方法主要有感染源控制、血管加壓類藥物、糖皮質激素等，但是治療的藥物昂貴、耗費的醫療資源多，給家庭和社會帶來了巨大的經濟壓力，所以膿毒癥的治療一直是全球關注的重點，診治方法也不斷更新[12]。其中連續性血液凈化 (Continuous blood purification，CBP) 就是目前大力推廣的一種膿毒癥支持療法，它是主要利用特殊材質的濾膜，連續、緩慢清除水分和溶質的一種治療方式[13]。CBP能過濾掉血中特定分子量的炎癥因子和趨化因子等其他抗炎介質和體內代謝毒素，如：IL-1、 IL-6、IL-10、TNF-α，調整免疫失控，使免疫系統的內環境逐漸恢復穩定，使凝血機制恢復正常[2,14]。目前，關于CBP對膿毒癥患者免疫功能和凝血功能的兩者造成的影響所見報道甚少。因此，本研究以膿毒癥患者為研究對象，對患者進行CBP治療，對患者持續性觀察，測定其細胞因子和凝血功能指標并進行APACHEⅡ評分，以期為臨床治療提供新的方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月至2015年1月入住新疆兵團第一師醫院重癥監護病房確診為膿毒癥的患者54例，其中男32例，女22例，年齡20～67歲，平均年齡 (49.57±12.98) 歲。原發病為：急性重癥胰腺炎30例，心血管疾病16例，腎病8例。膿毒癥的確診符合2008年國際會議所制定的關于膿毒癥診斷標準[15]，且年齡20～75歲。排除入院前接受透析治療者；近期使用過免疫抑制劑者；患自身免疫性疾病及惡性腫瘤者；HIV陽性者；終末期肝病或慢性腎功能衰竭者；升壓治療血壓 <80/40 mmHg者；APACHE II分值 >25的膿毒癥患者。

選取同期在醫院體檢的正常健康人54例，其中男30例，女24例，年齡21～66歲，平均年齡(50.30±12.15) 歲。膿毒癥患者與正常人群平均年齡及性別無統計學差異 (均P>0.05) 。本研究經新疆兵團第一師醫院倫理委員會討論通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 膿毒癥患者進行CBP (Continu-ous blood purification) 治療，CBP采用連續性靜脈血液濾過(Continuous veno-venous hemofiltration，CV-VH)方法，使用德國產Fresenius Medical Care ADM08/ABM 血濾系統，濾器為Fersenius Ultraffux AV600。所有患者均行CVVH治療72 h。在CBP治療的基礎上采用烏司他丁聯合治療，即20萬U加入50 ml 0.9%氯化鈉注射液中靜脈滴注，每次靜滴1 h，每8 h靜滴1次，連用5 d。肝素或低分子肝素抗凝，有活動性出血者行無肝素治療，有出血傾向者選擇低分子肝素抗凝。血流量150～250 ml/min，透析液流量25～45 ml/(h·kg)。同時使用APACH-EⅡ評分評價患者治療前、CBP治療12、24、48、72 h的整體病情變化。

1.2.2 標本采集時間及處理 所有膿毒癥患者治療前及治療后12、24、48、72 h共5次采集，正常人群僅采集1次血液。收集5 ml血液放入含EDTA的抗凝管中，300 r/min離心，留取血清，-20℃保存供ELISA法檢測IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α；同時留取細胞用流式細胞分析法檢測CD4+/CD8+；檢測凝血功能相關指標PT/APTT/TT/FIB。

1.2.3 凝血功能指標檢測 采用南京建成生物公司購買的凝血酶原時間 (Prothrombintime，PT) /部分凝血酶原時間(Active prothrombintime，APTT) /凝血酶時間 (Thrombin time，TT) 試劑盒，取離心收集的待測血漿0.1 ml，加入37℃預熱的PT/APTT/TT 0.2 ml試劑，混勻，立即使用STAGO公司產STA Compact全自動血凝分析儀檢測其凝血時間。使用上海明華體外診斷試劑有限公司生產的FIB免疫比濁法測定試劑盒，將離心收集的血漿，按照1∶10的比例稀釋血液樣品，取20 μl稀釋樣品及標準曲線樣品，分別加入500 μl纖維蛋白原抗體500 μl，37℃水浴30 min，上機VITALAB MICRO半自動生化分析儀檢測其含量。

1.2.4 流式細胞儀檢測 向50 μl抗凝全血[含細胞濃度為 (1～10) ×109L-1]中加入相應20 μl抗體 (FITC標記小鼠抗人CD4單抗，PE標記的小鼠抗人CD3單抗，BD TritestTMCD3/CD4/CD8購自美國BD公司) ，室溫下避光孵育20 min；然后加入300 μl溶血劑，混勻避光靜置10 min，1 400 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗滌1次，用新的PBS重懸細胞，避光靜置10 min，使用BD FACS Calibur流式細胞儀 (美國BD公司) 檢測，以CD3設門，分為CD4+淋巴細胞和CD8+淋巴細胞，計算出CD4+T、CD8+T淋巴細胞占外周血淋巴細胞的比例。

1.2.5 ELISA檢測細胞因子 細胞因子檢測試劑盒購買自BD公司，BD OptEIATMIL-1/IL-6/IL-10/TNF-α ELISA Kit。用鼠抗人IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α單克隆抗體包被ELISA板，4℃放置過夜。用PBST (含0.05%Tween-20) 洗滌，加入含10%FCS的PBS室溫封閉1 h；按照說明書配制標準品，并稀釋樣品，加入ELISA板中，室溫孵育2 h；洗板后，加入生物素標記的抗體及親和素標記的辣根過氧化物酶，室溫孵育1 h；洗板后，加TMB顯色劑，室溫避光反應30 min，加入10%終止Solution，全自動多功能酶標儀 (Thermo公司SM800) 450nm波長測值，計算細胞因子濃度。

2 結果

2.1 不同時間點凝血功能指標的變化 如表1所示，膿毒癥患者在治療前表現出凝血功能紊亂，PT、APTT、TT和FIB含量高于健康人群，差異具有統計學意義 (均P<0.05) 。CBP治療后，凝血功能檢測指標明顯得到改善，且隨著CBP治療時間的延長，凝血功能相關指標均逐漸降低 (均P<0.05) 。CBP治療12、24、48、72 h的凝血功能指標PT、APTT、TT、FIB相比CBP治療前顯著降低 (P<0.05) 。CBP治療12、24、48 h的凝血功能指標PT、APTT、TT顯著高于健康組 (均P<0.05) 。CBP治療12、24 h的凝血功能指標FIB顯著高于健康組 (均P<0.05) 。CBP治療48 h的凝血功能指標FIB與健康組相比無顯著差異 (P>0.05) 。CBP治療72 h的凝血功能指標PT、APTT、TT、FIB趨近于健康組，均無統計學意義 (均P>0.05) 。

表1 不同時間點凝血功能指標的比較

Tab.1 Comparison of coagulation function indexes at different time points

GroupsPTAPTTTTFIBHealthygroup127±11341±31143±1828±06BeforeCBPtreatment197±412)489±1122)225±632)43±102)CBPtreatmentfor12h172±401)2)435±911)2)194±461)2)39±071)2)CBPtreatmentfor24h158±271)2)396±711)2)173±291)2)34±061)2)CBPtreatmentfor48h136±211)2)367±591)2)153±181)2)29±061)CBPtreatmentfor72h130±131)346±281)148±131)27±041)

Note：Compared with before CBP treatment,1)P<0.05;compared with the healthy group,2)P<0.05.

2.2 不同時間點外周血免疫細胞變化 如表2所示，膿毒癥患者組的CD3+、CD4+和CD4+/CD8+細胞頻率較健康組明顯降低 (均P<0.05) ，表明膿毒癥患者的細胞免疫功能受到抑制。CBP治療12、24、48、72 h，相比治療前，CD3+T、CD4+T細胞頻率逐漸升高，具有統計學意義 (均P<0.05) 。CBP治療12、24、48、72 h的CD8+細胞頻率較治療前無顯著變化 (均P>0.05 ) 。隨著CBP治療時間的延長，外周血免疫淋巴細胞發揮調節作用，CBP治療12、24、48、72 h的CD4+/CD8+比例比治療前顯著升高 (均P<0.05) ，說明，經過CBP治療后膿毒癥患者的免疫抑制功能減弱，使其逐漸發揮正常的免疫功能。治療前、CBP治療12、24、48 h的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+細胞頻率低于健康組 (均P<0.05) 。CBP治療72 h的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+細胞頻率相比健康組無統計學意義 (均P>0.05) 。治療前、CBP治療12、24、48、72 h的CD8+細胞頻率相比健康組無顯著變化 (均P>0.05)。見圖1。

2.3 不同時間點細胞因子的變化 如表3所示，CBP治療12、24、48、72 h的IL-1、IL-6、IL-10的水平較治療前降低，差異具有統計學意義 (均P<0.05)。CBP治療48、72 h的TNF-α的水平較治療前顯著降低(均P<0.05) ，CBP治療12、24 h的TNF-α的水平較治療前無顯著差異 (均P>0.05) 。治療前、CBP治療12、24、48 h的IL-1的水平高于健康組 (均P<0.05) ，CBP治療72 h的IL-1的水平與健康組無差異 (P>0.05) 。治療前、CBP治療12、24、48、72 h的IL-6、IL-10的水平高于健康組 (均P<0.05) 。治療前、CBP治療12、24 h的TNF-α水平顯著高于健康組 (均P<0.05) 。CBP治療48、72 h的TNF-α水平與健康組相比無顯著差異 (均P>0.05) 。

2.4 CBP治療對膿毒癥患者APACHEⅡ評分的影響 膿毒癥患者CBP治療后，患者病情明顯改善，APACHEⅡ評價分數均下降 (圖2) 。治療前的APACHEⅡ評分為19.86±4.42，CBP治療12、24、48、72 h的APACHEⅡ評分分別為18.56±3.75、17.56±2.77、16.51±1.90、15.27±1.64。CBP治療12、24、48、72 h的APACHEⅡ評分與治療前比較均顯著降低 (均P<0.05) 。

表2 不同時間點外周血免疫細胞變化

Tab.2 Changes of peripheral blood immune cells at different time points

GroupsCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+(%)/CD8+(%)Healthygroup643±101418±89236±44188±057BeforeCBPtreatment461±822)276±912)229±35123±0442)CBPtreatmentfor12h524±551)2)328±691)2)233±26142±0311)2)CBPtreatmentfor24h582±461)2)367±581)2)235±23159±0311)2)CBPtreatmentfor48h611±341)2)391±391)2)232±30171±0241)2)CBPtreatmentfor72h636±571)413±341)236±19176±0211)

Note：Compared with before CBP treatment,1)P<0.05;compared with the healthy group,2)P<0.05.

GroupsIL?1IL?6IL?10TNF?αHealthygroup2086±1038642±247210198±213442843±3123BeforeCBPtreatment2976±0852)15123±42042)17019±41982)48947±86022)CBPtreatmentfor12h2538±0361)2)14356±35462)16052±36651)2)47485±77382)CBPtreatmentfor24h2319±0441)2)10504±33041)2)15576±32421)2)46287±90282)CBPtreatmentfor48h2197±0281)2)13457±37201)2)15243±28011)2)43834±56331)CBPtreatmentfor72h2103±0221)13238±29231)2)15123±24921)2)43112±37281)

Note：Compared with before CBP treatment,1)P<0.05;compared with the healthy group,2)P<0.05.

圖1 健康對照組和膿毒癥患者CD3+、CD4+和CD8+細胞流式細胞圖Fig.1 Flow cytometry of CD3+,CD4+ and CD8+ cells in healthy group and in patients with sepsisNote: A.Flow cytometry of CD3+,CD4+ and CD8+ cells in the healthy group;B.Flow cytometry of CD3+,CD4+ and CD8+ cells in the patients with sepsis before treatment;C.Flow cytometry of CD3+,CD4+ and CD8+ cells in the patients with sepsis after treatment.

圖2 CBP治療前后膿毒癥患者的APACHEⅡ評分Fig.2 APACHEⅡ score of sepsis patients before and after CBP treatment

3 討論

目前，膿毒癥的發病機制還不完全清楚，不僅與免疫系統失控和凝血系統紊亂相關、還與代謝紊亂、內分泌調節和神經系統調節等密切相關[16,17]。對免疫系統和凝血系統相關的分子機制進行研究，將有助于發現膿毒癥治療的新方法和確定新的治療手段，從而提高患者的生存率、降低膿毒癥的死亡率[18]。

對于膿毒癥患者，早期炎性介質的失衡是導致病情惡化的重要原因，CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+細胞在不同細胞因子的作用下分化為不同的效應T細胞，從而產生促炎細胞因子(TNF-α和 IFN-γ)，分泌抗炎介質 (IL-1、IL-6、IL-10)[19]。所以早期控制、清除炎癥因子及改善免疫功能是治療膿毒癥的關鍵。CBP通過對流與吸附作用，能有效去除體內多種炎性因子和促炎、抗炎介質 (IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α)，維持機體內環境穩態，從而改善免疫失調狀態[20]。本研究發現：膿毒癥患者經CBP治療12、24、48、72 h后，患者的體內炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α的水平較治療前顯著降低。

同時，膿毒癥患者體內炎癥因子、抗炎介質的增加會過度活化凝血系統，使纖溶物質下降、血液出現高凝狀態導致促凝和抗凝物質大量消耗，最終造成血液低凝狀態和出血傾向，臨床表現為 PT、APTT、TT不同程度的延長，CD3+T、CD4+T細胞頻率增加[21]。而CBP可以調節患者體內的水電解質體液平衡和酸堿平衡，使機體血液凝血狀態和纖溶物質的含量趨于正常，從而防止機體血流動力學和凝血纖溶系統的紊亂，使凝血系統恢復正常[22]。本研究中：膿毒癥患者經CBP治療12、24、48、72 h后，患者的凝血功能指標PT、APTT、TT、FIB相比CBP治療前顯著降低，CD3+T、CD4+T細胞頻率逐漸升高，CD4+/CD8+比例比治療前顯著升高。

而傳統的治療膿毒癥方法：如使用抗生素、糖皮質激素以及手術切除病灶、靜脈補液等只是單一的防止凝血系統的激活，抑制血液高凝狀態，并沒減少和清除體內的炎癥因子、促炎和抗炎介質，無法調節機體的免疫系統的失控，并不能達到滿意的治療效果[23]。CBP治療后能夠通過清除血液中炎癥因子，增強機體免疫功能，患者的免疫功能和凝血狀態均有所改善、生存率均有明顯提高，這表明CBP是治療膿毒癥的有效方法。本研究顯示，CBP治療能有效降低 APACHEⅡ評分，改善膿血癥患者的病情，從而緩解病情，降低患者死亡率。因此，CBP自從開始應用于膿毒癥患者的治療后，得到了廣泛的推廣和一致好評。

綜上所述，雖然膿毒癥患者經連續性血液凈化技術治療后，患者的凝血功能和免疫功能有所改善，對改善膿血癥患者的病情有一定幫助；但是血液凈化技術具體改善膿毒癥患者免疫功能和凝血功能的作用機制還不是很清楚，可能與減少體內炎癥因子和其他內毒素以及改善血液的血管內皮功能和纖溶組織有關。因此，未來需擴大樣本做進一步深入研究，為血液凈化技術對膿毒癥患者的治療提供更多的新思路和新手段。

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[收稿2016-01-28 修回2016-03-04]

(編輯 倪 鵬)

Effect of continuous blood purification on coagulation function and immune function in patients with sepsis

LI Jun，ZHANG Feng-Li，Tuergun Ai-Sha，WU Yan，LI Chao.

Intensive Care Unit,the First Division Hospital of Xinjiang Crops,Akesu 843000,China

Objective:To explore the functions of continuous blood purification(CBP) on blood coagulation function and immune function of patients with sepsis.Methods: From January 2012 to January 2015,54 patients who were hospitalized in the intensive care unit(ICU) of the first division hospital of Xinjiang Crops that in accordance with the diagnostic criteria of sepsis were enrolled into this experiment.All the patients were treated with CBP,and their APACHEⅡ scores before treatment and 12 h,24 h,48 h and 72 h after treatment were measured with persistent observation,respectively.Blood were collected from patients in different times after CBP treatment.The peripheral blood immune cells (CD4+/CD8),the levels of secreted cytokines (IL-1,IL-6,IL-10 and TNF-α),the coagulation function index (APTT,TT,PT) and FIB were detected by flow cytometry,ELISA,coagulation method and immunoturbidimetry,respectively.Results: The levels of PT,APTT,TT,and FIB of sepsis patients before CBP treatment were higher than those of healthy people (allP<0.05).Compared with before CBP treatment,the coagulation function indexes (PT,APTT,TT and FIB) were significantly reduced after CBP treatment for 12,24,48 and 72 h(allP<0.05).The frequencies of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+cells in the sepsis group were significantly lower than those in the healthy group (allP<0.05).After CBP treatment for 12,24,48 and 72 h,the frequencies of CD3+T and CD4+T cells were gradually increased when compared with those before CBP treatment (allP<0.05),while the CD4+/CD8+ratio was significantly higher than that before CBP treatment (allP<0.05).The frequencies of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+cells before CBP treatment and with CBP treatment for 12,24 and 48 h were lower than those in the healthy group (allP<0.05).After CBP treatment for 12,24,48 and 72 h,the levels of IL-1,IL-6 and IL-10 were lower than those before CBP treatment (allP<0.05).After CBP treatment for 48 h and 72 h,the levels of TNF-α were lower than those before CBP treatment (bothP<0.05).The levels of IL-1 before CBP treatment and with CBP treatment for 12,24 and 48 h were higher than those in the healthy group (allP<0.05),while the levels of IL-6 and L-10 before CBP treatment and with CBP treatment for 12,24,48 and 72 h were higher than those in the healthy group (allP<0.05).The levels of TNF-α before CBP treatment and with CBP treatment for 12 h and 24 h were higher than those in the healthy group (bothP<0.05).After CBP treatment for 12,24,48 and 72 h,the APACHEⅡ score were significantly lower than those before CBP treatment (allP<0.05).Conclusion: Our study provide strong evidence that CBP is helpful to improve the condition and enhance immune function of patients with sepsis by removing inflammatory factors in blood.

Continuous blood purification;Sepsis;Coagulation function;Cytokine;CD4+/CD8+;APACHEⅡ score;Interleukin;Peripheral blood T lymphocytes

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.021

①本文為新疆醫科大學第一附屬醫院2015年度院內科研基金項目(2015012)。

李 軍(1978年-)，男，碩士，主要從事膿毒癥血液凈化治療方面的研究。

R45

A

1000-484X(2016)11-1661-06

②新疆兵團第一師醫院神經內科，阿克蘇843000。

③通訊作者，新疆醫科大學第一附屬醫院RICU，烏魯木齊830000，E-mail:lichao20160113@163.com。