異基因骨密質來源間充質干細胞對小鼠急性GVHD的防治作用及其機制研究

喬淑凱 郭曉楠 張雅麗 任金海 王 穎 張靜楠 李 楊

(河北醫科大學第二醫院血液科,石家莊050000)

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異基因骨密質來源間充質干細胞對小鼠急性GVHD的防治作用及其機制研究

喬淑凱 郭曉楠①張雅麗 任金海 王 穎 張靜楠 李 楊

(河北醫科大學第二醫院血液科,石家莊050000)

目的：明確異基因骨密質來源的間充質干細胞(CB-MSCs)是否能有效防治急性GVHD，并進一步探討其可能的治療機制。方法：采用骨密質碎片法從C57BL/6(H-2b)小鼠分離和擴增MSCs。通過構建小鼠allo-HSCT后GVHD模型：雌性供鼠C57BL/6 (H-2b)→雄性受鼠BALB/c (H-2d)，然后觀察CB-MSCs移植對GVHD的影響。本實驗小鼠共分為4組：①單純照射組；②GVHD組；③GVHD+MSCs組；④正常對照組。在GVHD誘導后不同時間點觀察各組小鼠生存率、體重變化和臨床GVHD積分；應用ELISA方法檢測各組小鼠外周血細胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-4)和趨化因子(CCL5、CXCL9和CXCL10)濃度；應用流式細胞術檢測各組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg細胞)百分比和CD3+T細胞表面趨化因子受體CXCR3、CCR5和CCR7的表達。此外，我們還應用實時定量逆轉錄PCR(Real-time RT-PCR)方法檢測了各組小鼠骨髓中T-bet和GATA-3的mRNA表達水平。結果：CB-MSCs能顯著提高GVHD小鼠生存率、減少其體重缺失，并顯著降低臨床GVHD積分；CB-MSCs對GVHD的防治作用可能與降低外周血TNF-α、IFN-γ、CCL5、CXCL9和CXCL10濃度，增加Treg細胞百分比，下調T細胞表面CXCR3、CCR5的表達和上調CCR7的表達有關。此外，誘導骨髓Th1/Th2平衡向抗炎的Th2極傾斜可能也是CB-MSCs 對GVHD發揮治療作用的機制之一。結論：異基因CB-MSCs顯著增加了GVHD小鼠生存率。其治療機制可能與CB-MSCs能夠減少炎性細胞因子和趨化因子的釋放，誘導Treg的生成，調控T細胞表面趨化因子受體的表達，以及糾正Th1/Th2的失衡有關。

間充質干細胞；造血干細胞移植；移植物抗宿主病；調節性T細胞；趨化因子受體

移植物抗宿主病(GVHD)是異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)后一種嚴重的、威脅生命的并發癥，當前尚缺乏有效治療手段[1]。間充質干細胞(MSCs)是一類多能的非造血前體細胞，具有自我更新和多向分化潛能，研究證實，MSCs可以通過多種機制發揮抗炎和免疫抑制作用，其中包括抑制T細胞增殖、調控細胞因子和趨化因子的分泌、誘導細胞凋亡和促進調節性T細胞的生成等多種機制[2，3]。盡管目前臨床已有研究報道應用MSCs治療GVHD能取得良好療效，但其具體作用機制目前尚未完全闡明[4]。本研究采用骨密質碎片法分離和擴增MSCs，然后通過建立小鼠allo-HSCT后GVHD動物模型，觀察異基因骨密質來源MSCs共移植是否能夠有效預防或治療GVHD，并進一步探討其潛在的治療機制，為當前臨床應用MSCs治療GVHD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 用于MSCs培養的小鼠采用健康的雌性近交系C57BL/6(H-2b)小鼠，6～8周齡，體重在18～23 g/只；雄性的近交系BALB/c(H-2d)小鼠用于制備GVHD動物模型，8～10周齡，體重為23～25 g/只。上述小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，所有的實驗方案經河北醫科大學第二醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 C57BL/6 MSC完全培養基、C57BL/6 MSC成骨誘導完全培養基、C57BL/6 MSC成脂誘導完全培養基A、B和C57BL/6 MSC成軟骨誘導完全培養基以及油紅O、茜素紅和阿利辛藍染液均購于廣州Cyagen公司；RPMI1640培養液購自美國Thermo公司，胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；小鼠淋巴細胞分離液購于達科為生物有限公司；抗鼠CD3-FITC、抗鼠CD45-PE、抗鼠CD44-PE、抗鼠CD117-PE、抗鼠CD34-PE、抗鼠CD29-PE、抗鼠Sca1-PE、抗鼠CCR5-PE、抗鼠CCR7-APC、抗鼠CXCR3-PE、抗鼠CD4 PerCP-CD25 PE-Foxp3 Alexa Fluo以及相應的同型對照購自Biolegend公司；TNF-α、IFN-γ、IL-4、CCL5、CXCL9和CXCL10 ELISA試劑盒購于美國R&D公司；Real-time RT-PCR反應系統購于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠骨密質來源MSCs的分離、培養和鑒定 C57BL/6小鼠CB-MSCs的分離、培養、免疫表型檢測和多向分化潛能鑒定詳見我們以往的報道[5]。

1.2.2 小鼠GVHD模型的建立及實驗分組 根據以往文獻并改良建立小鼠GVHD模型[6]。建模過程簡述如下：BALB/c受體小鼠首先接受8 Gy全身X射線照射(TBI)(劑量率：0.5 Gy/min)，照射后6 h，0.2 ml細胞混合液(來自C57BL/6小鼠的1.0×107骨髓細胞和2.0×107脾淋巴細胞)經尾靜脈注射入受者鼠，同時給移植受鼠尾靜脈注射大腸埃希氏菌菌屬的細菌脂多糖(5 mg/kg)(LPS，055：B5)(Sigma公司)。此后給予移植受鼠正常飲食和高壓無菌水，并在無菌隔離籠中飼養。本實驗小鼠共分為四組：單純照射組，BALB/c僅接受8 Gy TBI(A組，n=20)；GVHD組，如模型建立所述(B組，n=20)；GVHD+MSCs共移植組，在GVHD基礎上，BALB/c受者鼠尾靜脈同時給予1×107CB-MSCs注射(C組，n=20)；正常對照組，健康、年齡匹配的BALB/c小鼠(D組，n=20)。各實驗組按一式兩份制備。一份用于觀察TBI后14 d內各組小鼠的生存率和體重變化情況；另一份用于定期處死小鼠作相關的實驗室檢測，探索CB-MSCs防治GVHD可能作用機制。

1.2.3 臨床GVHD評估 在移植后第7天和第14天，對受者小鼠GVHD的嚴重程度進行臨床評估，評估方法采用Cooke等[7]創建的評分系統，共涉及5項臨床參數：體重缺失(1分，體重缺失為10%～25%；2分，體重缺失>25%)；姿勢(1分，僅在休息彎腰駝背；2分，嚴重彎腰駝背妨礙運動)；活力(1分，>45%時間處于靜止狀態；2分，不刺激不活動)；毛發整潔度(1分，輕度至中度毛發蓬亂；2分，全身毛發蓬亂)；皮膚完整性(1分，縮放的爪子/尾巴；2分，明顯的毛發缺損，裸露皮膚)。臨床GVHD得分由上述5項參數的得分相加所獲得(積分范圍0～10)。

1.2.4 細胞因子和趨化因子水平檢測 在移植后不同時間點尾靜脈采集各組小鼠外周血，-20℃保存。應用ELISA方法測定各組小鼠外周血中細胞因子和趨化因子(TNF-α、IFN-γ、IL-4、CCL5、CXCL9-10)的含量，ELISA試劑盒購自于美國R&D公司，具體操作方法參照說明書，所有樣品和標準品的檢測均重復3次。

1.2.5 Treg比例測定和T細胞表面CXCR3、CCR5和CCR7表達分析 在移植后第7天獲取各組小鼠外周血，通過流式細胞術檢測Treg細胞比例和CD3+T細胞表面趨化因子受體的表達。具體流程如下：取各組小鼠外周血100 μl移至5 ml流式管中，分別加入相應的抗鼠CD4 PerCP-CD25 PE-Foxp3 Alexa Fluo、抗鼠CCR5-PE、抗鼠CCR7-APC和抗鼠CXCR3-PE抗體，輕柔渦旋后避光孵育30 min，每管分別加入2 ml紅細胞裂解液并混勻，室溫避光孵育10 min，1 300 r/min離心5 min，棄掉上清，2 ml緩沖液洗滌細胞1次，500 μl含2%多聚甲醛的緩沖液重懸細胞，然后用流式細胞儀檢測SP細胞Treg比例(CD4+CD25+Foxp3+CD4+)和CD3+T細胞表面CCR5、CCR7和CXCR3的表達情況。

1.2.6 骨髓組織T-bet和GATA-3 mRNA水平測量 在移植后不同時間點分別處死各組小鼠并分離其骨髓液，肝素抗凝，小鼠淋巴細胞分離液提取骨髓單個核細胞，Trizol法提取細胞總RNA，并在18 g/L瓊脂糖電泳下可見3條清晰亮帶(28s、18s、5s)，證明所提取的RNA模板完整；用紫外分光光度計測定吸光度A260/A280比值均大于1.8，并根據A280為1≌40 mg/L RNA進行含量測定。25 μl逆轉錄體系包含總RNA 2 μg，隨機引物25 ng，5×RT緩沖液5 μl，dNTPs(2 mmol/L)1 μl，M-MLV逆轉錄酶(100 U/μl)1 μl，Rnasin(10 U/μl)2 μl，Mg2+(25 mmol/L)1 μl，去離子雙蒸水補足體系，37℃水浴60 min，94℃滅活逆轉錄酶，獲取的cDNA于-20℃冰箱保存備用。所有引物經上海生物工程公司鑒定并合成，引物序列如下：T-bet引物 ，Sense:5′-TCAACCAGCACCAGACAGAG-3′；Antisense: 5′-AACATCCTGTAATGGCTTGTG-3′。GATA-3引物,Sense:5′-CTTATCAAGCCCAAGCGAAG-3′；Antisense: 5′-CCCA-TTAGCGTTCCTCCTC-3′。β-tubulin引物：Sense:5′-GGTAACAACTGGGCGAAGGG-3；Antisense: 5′-CATGACGCTAAAGGAGTTCA-3′。PCR反應體系為25 μl，包括cDNA 2 μl，SYBR Green 1.25 μl，無氧核酸水10.75 μl，上、下游引物20 pmol/L各2 μl。反應條件：95℃預變性3 min，然后95℃變性30 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40次循環結束。每一樣本檢測均做3個平行管以保證其結果的準確性。T-bet和 GATA-3靶基因相對于內對照β-tubulin的表達量用2-ΔCt表示。

2 結果

2.1 CB-MSCs增加GVHD小鼠生存率，并減少其體重缺失 除GVHD組小鼠出現明顯腹瀉外，所有接受致死劑量TBI的小鼠在照射后第1周內均表現出相似的臨床表現：體重進行性下降及如下一些癥狀，包括疲倦、毛發豎立和彎腰駝背等。隨后CB-MSCs處理后的GVHD小鼠體重開始逐漸回升。各組小鼠在移植后45 d內的生存曲線如圖1A所示。從中我們可以發現單純照射組、GVHD組和GVHD+MSCs組小鼠的中位生存期分別為(7.8±0.7)d、(16±3.4)d和(56±4.8)d。單純照射組小鼠在TBI后13 d內全部死亡，GVHD組在TBI后45 d僅有大約20%的小鼠生存，而CB-MSCs處理后GVHD組小鼠在TBI后45 d仍保留了50%以上的生存率。生存結果分析顯示，GVHD+MSCs組小鼠生存率明顯高于GVHD組(P<0.05)，說明CB-MSCs顯著延長了GVHD小鼠的生存時間。圖1B顯示了各組小鼠在TBI后不同時間點體重變化情況，從中可以看出，CB-MSCs顯著降低了GVHD小鼠的體重缺失(P<0.05)。

2.2 CB-MSCs降低小鼠GVHD的嚴重程度 在allo-HSCT后2周內，GVHD組小鼠出現進行性加重的急性GVHD癥狀，主要表現為體重減輕、活力下降、毛發豎立、彎腰駝背以及腹瀉等癥狀。而CB-MSCs輸注后的GVHD小鼠上述癥狀出現的時間相對較晚、程度較輕。在移植后第7天和第14天，MSCs+GVHD組小鼠GVHD臨床積分均明顯低于單純GVHD組(P<0.01，圖2)。這些結果表明，CB-MSCs能顯著減輕allo-HSCT后GVHD的嚴重程度。

2.3 CB-MSCs降低GVHD小鼠外周血中炎性細胞因子和趨化因子的水平 我們用ELISA方法檢測了各組小鼠移植后不同時間點外周血中各種細胞因子和趨化因子的水平，實驗結果如圖3所示。從圖中可以看出，無論是單純照射組、GVHD組和MSCs+GVHD組小鼠，其外周血中細胞因子TNF-α和IFN-γ的濃度與正常對照組相比均有不同程度的增加，其中以GVHD組小鼠增加的程度最為顯著，并且峰值出現在移植后第3天；而CB-MSCs在移植后第3天和第7天顯著降低了GVHD小鼠TNF-α和IFN-γ濃度(P<0.01)；相反，各組小鼠外周血中IL-4水平則無顯著差異(P>0.05)。與細胞因子相似，CB-MSCs在移植后第7天顯著降低了GVHD小鼠外周血中趨化因子CCL5、CXCL9和CXCL10濃度(P<0.01)，但在移植后第3天，則僅CXCL9濃度下降(P<0.01)；與之相比，單純照射組小鼠CCL5、CXCL9和CXCL10水平與正常對照相比則無明顯差異(P>0.05)。這些結果提示，CB-MSCs能夠抑制GVHD小鼠外周血炎性細胞因子和趨化因子的生成。

圖1 CB-MSCs增加GVHD小鼠生存率(A)并減少其體重缺失(B)Fig.1 CB-MSCs increased survival rates (A),caused a reduction of weight loss (B) in GVHD miceNote: Survival rate was determined using a log rank (Mantel-Cox) test.The weight after allo-HSCT is shown as a percentage of pre-irradiation weight.

圖2 CB-MSCs顯著降低GVHD小鼠臨床GVHD積分Fig.2 CB-MSCs reduced clinical GVHD scores in GVHD miceNote: **.P<0.01,compared with GVHD group.

圖3 CB-MSCs抑制GVHD小鼠外周血炎性細胞因子和趨化因子的生成Fig.3 CB-MSCs suppressed production of inflammatory cytokines and chemokines in peripheral blood in GVHD miceNote: **.P<0.01,compared with GVHD group.

圖4 CB-MSCs促進GVHD小鼠Treg細胞的生成Fig.4 CB-MSCs promoted expansion of Treg cells in GVHD miceNote: *.P<0.05,compared with GVHD group.

2.4 CB-MSCs促進GVHD小鼠外周血Treg細胞的生成 我們通過流式細胞儀計數CD4+CD25+Foxp3+的細胞來檢測Treg細胞，代表性的Treg細胞流式檢測圖見圖4A。GVHD組和GVHD+MSCs組小鼠外周血中Treg細胞百分比(CD4+CD25+Foxp3+/CD4+)如圖4B所示。從中可以看出，在移植后第7天，GVHD+MSCs組小鼠Treg細胞百分比明顯高于GVHD組(P<0.05)。

2.5 CB-MSCs改變了GVHD小鼠外周血T細胞表面趨化因子表達譜 我們用流式細胞術檢測了各組小鼠外周血CD3+T細胞表面趨化因子受體CXCR3、CCR5和CCR7的表達情況，其結果如圖5所示。從中可以看出，與GVHD組相比，CB-MSCs輸注顯著降低了CD3+T細胞表面CXCR3和CCR5的表達(P<0.01)，相反卻明顯增加了CCR7的表達(P<0.01)。這些結果表明CB-MSCs移植通過下調CCR5、CXCR3和上調CCR7的表達，扭轉了GVHD小鼠T細胞表面異常的趨化因子表達譜，從而進一步抑制了T細胞的趨化能力，減少了其向靶器官的遷徙和浸潤。

2.6 CB-MSCs促進GVHD小鼠骨髓組織Th1/Th2

圖6 CB-MSCs對T-bet、GATA-3 mRNA表達以及T-bet/GATA-3比率的影響Fig.6 Effects of CB-MSC on T-bet,GATA-3 mRNA expressions and T-bet/GATA-3 ratiosNote: **.P<0.01，*.P<0.05 compared with GVHD group.

平衡向Th2極轉化 各組小鼠骨髓組織中轉錄因子T-bet、GATA-3 mRNA表達水平和T-bet/GATA-3比率如圖6所示。從圖中可以看出，在移植后第3天和第7天，GVHD組小鼠Th1型轉錄因子T-bet mRNA表達水平與正常對照組相比顯著增加(均P<0.01)；而GVHD+MSCs組小鼠T-bet mRNA水平在移植后第3天(P<0.05)和第7天(P<0.01)明顯低于GVHD組；與之相反，Th2型轉錄因子GATA-3在各組小鼠之間則無顯著差異(P>0.05)。更重要的是，在移植后第3天和第7天，T-bet/GATA-3比率在GVHD+MSCs組也明顯低于GVHD組(均P<0.01)。這些結果表明，CB-MSCs能夠顯著抑制GVHD小鼠Th1型免疫反應，并促使GVHD小鼠Th1/Th2平衡向抗炎的Th2極傾斜。

3 討論

近年來，MSCs的免疫抑制能力被人們廣泛關注，并在動物模型和臨床試驗中被用于預防或治療各類炎癥性疾病、自身免疫性疾病和GVHD[8-10]。然而MSCs并不是天然的免疫抑制劑，其免疫抑制活性與它所處的周圍環境密切相關。研究表明，將MSCs置于炎性細胞因子環境，其能夠發揮更強的免疫抑制作用[11]。Polchert等[12]也報道，用IFN-γ預處理的MSCs在體內能更有效預防GVHD發生。Joo等[13]在小鼠GVHD模型中將異基因MSCs經尾靜脈輸注到體內，然后對其在體內進行示蹤，結果發現MSCs植入受者體內后首先到達肺部，隨后再遷移到胃腸道、淋巴結和皮膚。在前期研究的基礎上，我們通過小鼠動物模型在國內外率先嘗試應用CB-MSCs來預防或治療GVHD。我們的結果顯示，CB-MSCs不僅明顯減輕了GVHD小鼠的嚴重程度，而且顯著增加了其生存率。以往有研究報道，在其他一些臟器移植和自身免疫性疾病動物模型中，MSCs能直接通過誘導Treg生成而發揮保護性作用[14，15]，我們的實驗結果與之相一致，發現 CB-MSCs顯著增加了GVHD小鼠外周血Treg細胞百分比，從而證實Treg細胞擴增可能是CB-MSCs降低GVHD嚴重程度的機制之一。

近年來，國內外陸續有研究報道，某些趨化因子受體及其配體的相互作用在GVHD的發生過程中起著決定性作用[16,17]。我們的研究表明，CB-MSCs顯著下調了外周血T細胞表面CCR5和CXCR3的表達，相反卻明顯上調了CCR7的表達，這種改變一方面減少了供者T淋巴細胞向GVHD靶器官遷徙浸潤，另一方面促使其向次級淋巴組織歸巢。因此改變T細胞表面趨化因子受體表達譜，可能也是CB-MSCs對GVHD發揮治療作用的機制之一。在Th1/Th2免疫平衡方面，有研究認為其在機體免疫調控方面亦發揮極其重要的作用，Th1/Th2的失衡可能也參與GVHD的發病過程[18]。因此，我們觀察了GVHD小鼠骨髓組織Th1/Th2平衡情況以及CB-MSCs輸注后對其的影響，結果顯示，CB-MSCs主要是降低GVHD小鼠Th1型轉錄因子T-bet mRNA水平，而對Th2型轉錄因子GATA-3 mRNA表達無顯著影響，這導致T-bet/GATA-3比值顯著下降，促使GVHD小鼠Th1/Th2平衡向Th2極傾斜，從而減輕了Th1免疫亢進所致的組織損傷，這或許也是CB-MSCs對GVHD發揮治療作用的又一機制。

盡管MSCs能在GVHD的預防或治療中發揮關鍵作用，但其廣泛的臨床應用目前仍存在相當大的爭議。絕大多數研究顯示，MSCs移植是一種臨床可行且相對安全的治療手段，對患者無明顯不良反應[19,20]。然而也有一些研究持相反觀點，他們認為由于MSCs具有多向分化和免疫抑制潛能，因此并不能完全排除其發生惡性轉化的可能。Galiè等[21]報道，MSCs輸注有形成自發性惡性腫瘤的可能，他們在接受MSCs輸注的動物模型中觀察到轉化細胞，并發現其具有累積性染色體異常。在臨床試驗中，Ning等[22]也報道，對惡性血液病患者同時進行HSCT和MSCs移植，患者有更高的復發率。綜上所述，雖然MSCs潛在的治療風險仍需要大量的臨床實驗進一步去證實，但我們相信MSCs的治療仍將會對廣大GVHD患者大有裨益。

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[收稿2016-01-13]

(編輯 倪 鵬)

Allogeneic compact bone-derived mesenchymal stem cells attenuates severity of GVHD in a murine bone marrow transplantation model

QIAO Shu-Kai,GUO Xiao-Nan,ZHANG Ya-Li，REN Jin-Hai,WANG Ying，ZHANG Jing-Nan,LI Yang.

Department of Hematology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

Objective:To determine whether allogeneic murine compact bone derived-mesenchymal stem cells (CB-MSCs) could prevent the development of GVHD and investigate the potential mechanism.Methods: MSCs were isolated and amplification from C57BL/6 (H-2b) mice by bone fragments method.The effects of CB-MSCs on GVHD were tested by using an established murine model of C57BL/6(H-2b)→BALB/c(H-2d).The mice were divided into 4 groups:①simple irradiation group;②GVHD group;③GVHD+MSCs group;④the normal control group.Survival rates,body weight change and clinical GVHD scores were assessed after GVHD induction.Mechanistically,concentrations of cytokines (TNF-α,IFN-γ and IL-4) and chemokines (CCL5,CXCL9 and CXCL10) from peripheral blood in the recipient mice were measured at different time point post-transplantation.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell (Treg) percentage,CCR5,CXCR3 and CCR7 expression on CD3+T cells,and T-bet and GATA-3 mRNA levels were also evaluated at different time point post-transplantation.Results: CB-MSCs significantly attenuated the severity of GVHD and increased survival rate of mice.A higher Treg percentage,reduction of TNF-α,IFN-γ,CCL5,CXCL9 and CXCL10 levels,down-regulation of CXCR3 and CCR5,as well as up-regulation of CCR7,were observed in MSCs infused mice.Also,the prophylactic effect of CB-MSCs was associated with a shift of Th1/Th2 balance toward anti-inflammatory Th2 polarization.Conclusion: Allogeneic CB-MSCs may offer a novel prophylactic approach for GVHD after allo-HSCT.

Mesenchymal stem cell;Hematopoietic stem cell transplantation;Graft-versus-host disease;Regulatory T cell;Chemokine receptors

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.023

喬淑凱(1975年-),男,博士,副教授,主要從事移植免疫相關研究, E-mail: saidesa@163.com。

R392.4

A

1000-484X(2016)11-1672-06

①通訊作者,E-mail: xiaonangi@medmail.com.cn。