響應面優化超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的工藝研究

◎王華芳

（三門峽職業技術學院食品園林學院，河南三門峽4 7 2 0 0 0）

響應面優化超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的工藝研究

◎王華芳

（三門峽職業技術學院食品園林學院，河南三門峽4 7 2 0 0 0）

利用響應面分析法（RSA）對杜仲葉總黃酮提取工藝進行優化，通過了三因素三水平17組實驗，考察了萃取溫度、壓強和時間對黃酮提取含量的影響。通過二次項回歸方程分析，預測出最佳萃取工藝條件，即溫度51℃，壓強31.15MPa，時間90min，最高總黃酮含量為45.86mg/g。在最佳工藝條件下進行驗證試驗，所得總黃酮的含量為45.82mg/g，與預測結果吻合。

響應面分析；超臨界CO2；總黃酮

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是一種名貴的中藥材，蘊含有豐富的天然活性物質，如木脂素類、多糖、有機酸、黃酮類化合物等，其中黃酮類化合物是杜仲藥效的主要活性成分之一，具有擴張冠狀血管、促進血液循環、抗炎、抗病毒、抗癌、保肝利水、美容美發及祛斑等功效[1-4]，被廣泛用于藥品、食品及保健品中。鄧素蘭[5]等對杜仲根、莖、葉等不同部位中黃酮含量進行了測定，發現其各部位均含有總黃酮。相較于杜仲根莖，杜仲葉資源異常豐富，研究開發杜仲葉次生代謝物總黃酮提取，可實現杜仲資源的最大效益化。

超臨界流體萃取技術是上世紀80年代引入我國的一種新型萃取技術，主要是利用高于臨界壓力和臨界溫度條件下的流體作為萃取劑，從目標物物種將有效成分萃取出來，具有提取率高、中藥有效成分不被破壞、操作溫度低，無有機溶劑殘留、工藝簡單等優點[6]。目前超臨界CO2萃取技術已經被應用于中草藥有效成分提取中，但是其在杜仲葉總黃酮提取工藝上的研究相對較少。

響應面優化法（RSM）是一種實驗尋優方法，適宜于解決非線性數據處理的相關問題，通過對模型過程的回歸擬合等求出并預測實驗最優條件，由于其考慮了實驗隨機誤差，計算簡便，在實驗尋優過程中可以連續地對實驗的各水平進行分析，因此被廣泛用于實驗設計中。

本研究利用超臨界CO2流體萃取技術，以總黃酮提取含量為響應值，通過響應面法得到回歸方程，優化并驗證杜仲葉中總黃酮提取最佳工藝，為今后杜仲葉藥用資源的開發和利用提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和試劑

杜仲葉采于河南省靈寶市，洗凈、烘干、粉碎過40目篩后備用；蘆丁標準品，中國藥品生物制品鑒定所；無水乙醇、甲醇、醋酸、醋酸鈉、二氯氧鋯等均為分析純；蒸餾水。

1.2 主要儀器

FA604A電子天平上海精天電子儀器有限公司；722型紫外可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；超臨界CO2萃取儀HA120-50-01型超臨界萃取裝置；中興高速萬能粉碎機北京中興偉業儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱上海滬升實驗儀器廠；

1.3 實驗方法

1.3.1 杜仲葉總黃酮的萃取

準確稱取粉碎后的杜仲葉原料5.0000g放入萃取釜，夾帶劑（甲醇）流量設置為0.5L/min，設定溫度、壓力和萃取時間，通入流量為2L/min的CO2進行萃取，萃取結束后收集提取液，過濾，待測定其吸光度值，并計算總黃酮濃度。

1.3.2 蘆丁標準曲線繪制[7]

0.05000 mg/mL蘆丁標夜的配制：精密稱取25.00mg蘆丁標準品，置于500ml容量瓶中，用甲醇定容，得0.05000mg/mL蘆丁標準溶液。

pH=4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液：準確稱取醋酸鈉16.4000g,然后加冰醋酸20.00mL,加入蒸餾水攪拌溶解后定容至100mL容量瓶中。

標準曲線繪制：取10.00mL比色管6支，分別加入蘆丁標液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL,再依次加入1.00mL醋酸-醋酸鈉溶液，2.00mL2%二氯氧鋯甲醇溶液，最后以甲醇定容，混勻。以試劑空白為對照參比溶液，待靜置70min后分別測定其在440nm處的吸光度值。得到蘆丁溶液質量濃度ρ（μg/ mL）與吸光度值A的回歸方程，即A=aρ+b。

1.3.3 杜仲葉總黃酮提取量的測定

將杜仲葉提取液過濾后定容至100mL,準確吸取1.00mL樣品置于10.00mL比色管中，依次加入1.00mL醋酸-醋酸鈉溶液，2.00mL2%二氯氧鋯甲醇溶液，最后以甲醇定容、混勻后測定其在440nm處的吸光度值，并代入標準曲線回歸方程計算總黃酮的含量。

1.3.4 試驗設計及分析

在單因素實驗的基礎上,根據Box-behnken實驗設計原理運用Design Expert7.0設計響應面實驗，分別以萃取溫度、萃取壓力和萃取時間這三個因素三水平共計17個實驗點進行組合實驗設計，以提取總黃酮的含量為判別指標確定最佳工工藝條件。

2 結果與討論

2.1 標準曲線繪制

按照1.3.2方法配制系列不同濃度的蘆丁溶液，測量其吸光度值，同時以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，建立蘆丁標準曲線，見圖1，擬合線性回歸方程為：A=0.00346ρ-0.0053，R2=0.9990，線性關系良好。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 萃取溫度對黃酮提取效果的影響

準確稱取5.00g杜仲葉粉末5份，設置夾帶劑（甲醇）流量為0.5L/min，CO2流量為2L/min，設定壓力30MPa,萃取時間90min，按照1.3.2中方法分別測定溫度在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下的吸光度值，考察溫度對萃取總黃酮的影響。

由圖2可知，當壓強和萃取時間固定后，隨著溫度的升高，總黃酮含量先升高后降低，并且在55℃下達到最高值，這可能是隨著溫度的升高，黃酮溶解度增加，之后由于溫度過高，導致CO2流體密度降低所致[8]，因此選擇55℃下萃取是比較合適的。

2.2.2 萃取壓力對黃酮提取效果的影響

準確稱取5.00g杜仲葉粉末5份，將甲醇夾帶劑流量設置為0.5L/min，CO2流量為2L/min，設定溫度55℃,萃取時間90min，按照1.3.2中方法分別測定20MPa、25MPa、30MPa、35MPa、40MPa壓力下提取液的吸光度值，考察壓力對總黃酮的萃取效果，結果見圖3。

由圖3可以看出，隨著壓強由20MPa逐步上升到30MPa的過程中，黃酮提取含量呈現上升的趨勢，超過30MPa后，呈下降趨勢，下降幅度小于增長幅度。可能是由于壓力增大，CO2流體與溶質之間的滲透增大，有利于萃取。當壓強過高時，由于高壓下CO2的可壓縮性小，密度降低，溶解力降低[8]。另外，從設備安全性角度考慮，壓強也不能太高。因此，壓強取30MPa比較合適。

2.2.3 萃取時間對提取效果的影響

準確稱取5.00g杜仲葉粉末5份，將甲醇夾帶劑流量設置為0.5L/min，CO2流量為2L/min，設定溫度55℃,壓力30MPa，按照1.3.2中方法分別測定不同萃取時間30min、60min、90min、120min、150min下提取液的吸光度值，通過計算杜仲葉總黃酮的含量，進一步考察萃取時間對提取杜仲葉總黃酮含量的影響。

由圖4可知，隨著萃取時間的延長，杜仲葉中黃酮含量顯著上升，主要是這主要是時間延長，增加了溶劑溶質接觸的時間，有利于萃取完全。但是當萃取時間超過90min后增幅減緩，考慮原因是隨著時間的延長，原料中雜質相對含量在增加，而有效溶質的量則是在減少，動力消耗在增加，操作費用增加，同時也降低了設備的生產強度[9]。因此，從提高效率和節約資源的角度，選擇90min比較合適。

圖1 蘆丁溶液標準曲線圖

圖2 溫度對提取杜仲葉總黃酮含量的影響

圖3 萃取壓力對提取杜仲葉總黃酮含量的影響

圖4 萃取時間對提取杜仲葉總黃酮含量的影響

表1 響應面實驗因素水平表

表2 響應面設計方案及結果

表3 響應面二次模型的方差分析表

2.3 響應面分析與優化實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計方案

綜合單因素實驗結果，依據Design Expert7.0軟件，根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，采用響應面法在三因素三水平上對實驗進行優化，實驗因子和水平見表1。

根據表1設定的因素和水平，按表2實施17次試驗，得到各個實驗條件下的黃酮提取含量。以A（萃取溫度）、B(萃取壓強)和C（提取時間）為自變量，總黃酮提取含量（Y）為響應值，建立杜仲葉總黃酮提取含量的回歸方程為:

注：模型的R2=0.9988，R2Adj=0.9972,R2pred= 0.9885 Adeq Precision=66.42

由表3可以看出該模型極顯著（p＜0.0001），在統計學上具有意義，同時，信噪比值（66.42）很高，失擬項值0.3224也大于0.05，充分表明該模型與試驗的擬合度良好，可用于預測。另外，模型的R2= 0.9988，R2Adj=0.9972，說明響應值的變化有99.88%來源于所選自變量，R2Adj=0.9972,R2pred=0.9885，兩者相近，說明回歸方程線性關系良好，這進一步說明回歸方程可以替代真實點對實驗結果進行分析和預測。

響應面3D圖和等高線圖能夠通過響應值在圖像上的直觀表現反應各因素及各因素交互作用對總黃酮提取效果的影響。運用Design Expert7.0軟件，將因素兩兩比較分析并繪制響應面3D曲線圖，結果見圖5-圖7.

圖5 溫度-壓強兩因素交叉響應面曲線圖

從圖5可以看出，壓強對總黃酮提取效果的影響較溫度顯著，曲面較陡，隨著溫度的升高，提取效果呈現先上升后下降的趨勢，下降趨勢明顯與升高趨勢。圖5等高線圖成近似圓形，說明壓強和溫度之間的交互作用不明顯。從圖6可知，相較時間，溫度對總黃酮提取效果的影響較顯著，曲面陡峭，而時間曲線則比較平緩。等高線呈橢圓形，說明兩者的交互作用較顯著。同理，分析圖7可知，壓強對總黃酮提取效果影響較顯著，時間則不顯著。等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用顯著。綜合三張圖可知，各因素對總黃酮提取效果的影響大小依次為：壓強＞溫度＞時間。

2.3.3 驗證結果

經過響應面回歸方程分析，得到該模型下總黃酮的最佳提取工藝條件為：溫度51.05℃，壓強31.15MPa，時間90min，在此條件下，杜仲葉總黃酮提取含量的預測值為45.86mg/g.為了檢驗響應面優化預測實驗結果的可靠性，在上述條件下進行三次平行試驗，得到杜仲葉總黃酮平均提取含量為45.82mg/g，相對誤差約為0.09%，且是所有試驗中最高提取結果，該值與響應面預測值基本吻合，也進一步驗證了響應面二次回歸方程應用于杜仲葉總黃酮提取實驗尋優體系的可靠性。

圖6 溫度-時間兩因素交叉響應面曲線圖

圖7 壓強-時間兩因素交叉響應面曲線圖

3 結論

通過響應面優化實驗建立了杜仲葉總黃酮提取二次回歸方程模型，回歸方程為:Y=44.81-1.79A+ 1.31B+1.04C-1.13A*B+0.79A*C-0.32B*C-3.04A2-2.65B2-0.21C2并預測了最佳工藝條件，即：溫度51℃，壓強31.15MPa，時間90min，最高總黃酮含量為45.86mg/g。同時，通過方差分析可知，二次曲線回歸模型的p＜0.0001，為極顯著水平，在統計學上具有意義，且信噪比值（66.42）很高，失擬項值0.3224也大于0.05，這些都充分說明實驗所得二次回歸模型與試驗的擬合度良好，可用于預測。在最佳工藝條件下進行驗證試驗，通過方差分析，得到總黃酮的含量為45.82mg/g，與預測結果吻合。

[1]楊芳，岳正剛，王欣，等.杜仲葉化學成分的研究[J].中國中藥雜志，20 1 4,39（8）：1 4 4 5-1 4 4 9.

[2]李建民，等.杜仲抗氧化生物活性研究進展[J].中醫藥學報，20 1 0,3（8）：1 3 8.

[3]孟良玉，蘭桃芳，盧佳琨，等.敗醬草中黃酮類化合物提取及其抗氧化活性[J].食品科學，2 0 1 0,3 1（24）：21 4-2 1 7.

[4]周程艷,馬紅翠,王美,等.不同采收期杜仲葉和果實總黃酮和多糖含量比較[J].中國實驗方劑學雜志,2 0 1 1,1 7(1 1):1 1 1-1 1 4.

[5]鄧素蘭，余繼宏，管林.杜仲不同部位總黃酮含量的測定[J].生物質化學工程,2 0 0 7，3（4 1）：37-3 8.

[6]屈躍剛.刺五加總黃酮提取工藝的研究[D].長春：長春工業大學，20 1 2年.

[7]仇豪文，沈暉，曾里，等.杜仲葉總黃酮檢測方法的改進研究[J].食品研究與開發,20 1 3,34(20):9 6-1 0 0.

[8]楊俊蘭，馬一太，曾憲陽,等.超臨界壓力下CO2流體的性質研究[J].流體機械，2 0 0 8,3 6（1）:5 3-57.

[9]朱蘭保，盛蒂，常曉梅.超臨界CO2萃取菊花秸稈中總黃酮的研究[J].飲料工業，2 0 0 8,1 1（7:）1 4-1 6.

（責任編輯 卞建寧）

TS201.1

：B

：1671-9123（2016）01-0140-05

2015－12－18

王華芳（1982-），女，河北邯鄲人，三門峽職業技術學院食品園林學院講師。