微生物轉化去氫表雄酮生成7琢 15琢—二羥基雄烯醇酮的研究

蔣衛敏

摘 要：7α，15α-二羥基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中間體，應用亞麻刺盤孢（Colletotrichum lini AS 3.4486）的羥化酶體系對去氫表雄酮（DHEA）底物進行轉化，合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮。文章采用平板篩選、投料方法、發酵過程的控制，在去氫表雄酮（DHEA）投料濃度10 g/L的條件下，轉化率可達80%以上，主要產物為7α，15α-二羥基雄烯醇酮。比原來的投料濃度有較大的提高。

關鍵詞：去氫表雄酮；亞麻刺盤孢；7α，15α-二羥基去氫表雄酮；微生物轉化工藝

中圖分類號：R977.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-8937（2016）33-0211-03

1 概 述

隨著甾體化學的飛速發展，甾體激素類藥物已逐漸成為醫藥領域的重要門類。屈螺酮是一種高效、低毒、副作用小的新一代女用避孕藥。由于屈螺酮具有廣闊的市場前景，其前體化合物7α，15α-二羥基去氫表雄酮也受到廣泛關注。之前合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮主要使用化學方法，由于化學法合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮步驟繁瑣，產物收率低，對人和環境影響大。

20世紀70年代德國先令首先將生物轉化法用于屈螺酮的合成，利用微生物的羥化酶體系，在去氫表雄酮的C7和C15位引入羥基，得到7α，15α-二羥基去氫表雄酮，再經化學法合成屈螺酮。使用微生物法引入羥基縮短了屈螺酮的合成路線，但其轉化效率較低。目前對去氫表雄酮轉化效率比較高的菌株主要來自Colletotrichum lini屬，但高濃度的DHEA對具有菌種具有毒害作用，因此尋找耐受性強、轉化率高、生命力強的菌種非常重要。

由于絲狀真菌的細胞壁成份復雜，直接以孢子或菌絲進行誘變比較難。本實驗通過孢子稀釋培養篩選生長速度快的菌種，選擇加料溶劑、以及添加表面活性劑和各種轉化條件的控制，達到最佳培養條件以提高投料濃度和轉化率。

2 材料與方法

2.1 菌 種

亞麻刺盤孢由本實驗室保存

2.1.2 培養基

斜面培養基PDA（g/L）：土豆200，葡糖糖20，瓊脂20，pH自然

種子（發酵）培養基（g/L）：葡糖糖30，玉米漿10，磷酸二氫鉀1，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂0.244，泡敵適量

2.1.3 試 劑

DHEA，7α，15α-二羥基去氫表雄酮，7α-羥基去氫表雄酮由本實驗室分離制備。培養基各種營養成分購置上海試劑公司，投料使用的各種溶劑為工業級，分析使用試劑均為分析純。

2.1.4 使用儀器

菌種培養箱（上海博訊實業有限公司SPX-150B-Z型），恒溫搖床（上海世平的SPH-211C），臺式離心機（TGL-16C高速離心機），立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安LDZX-75KBS），菌種保藏（杭州華日電冰箱股份有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化有限公司），顯微鏡， 高效液相色譜。

2.2 試驗方法

2.2.1 生長速率快菌種篩選

PDA培養基的配置，土豆去皮稱取200 g，切成小塊置燒杯中加水1 000 ml，煮沸5～10 min，用紗布濾去土豆塊，加水補充蒸發水分，加入20克葡萄糖和20克瓊脂溶解，分裝滅菌。滅菌之后均勻的傾到于平皿，冷卻凝固，28 ℃培養2天備用。取保存菌種用無菌水洗下孢子，吸取1 ml加入到裝有9 ml無菌水的試管中，為101，混合均勻之后按同樣方法稀釋，直至1010，取104～108每級涂布5個平皿，29 ℃培養。

2.2.2 生長速度快菌株的擴培

選擇平皿中生長速度快，顏色深的菌落，擴培到茄形瓶中，29 ℃培養，待種子成熟之后，保存于冰箱。

2.2.3 孢子懸浮液的培養

將無菌水加入亞麻刺盤孢霉菌茄形瓶保藏培養基中，用接種環輕輕刮取表層孢子，將洗下的孢子懸浮液置于無菌的盛有玻璃珠的三角瓶內，打散孢子懸浮液約20 min。用血球計數板計算孢子懸浮液的濃度。將計數后的懸浮液于4 ℃冰箱內保藏。盡量保證優化過程中每瓶菌種生長狀態一致。

2.2.4 亞麻刺盤孢生長曲線的測定

采用過濾法測定菌體的生物量。取24個容量為500 ml的搖瓶，注明培養時間，分別準確加入100 ml種子培養液，120 ℃滅菌30 min。接種前置無菌室開紫外燈30 min，向每瓶培養基中分別加入1 ml孢子懸浮液，29 ℃、160 rpm/min培養。

從開始培養每隔4 h取2瓶，用恒重的濾紙抽濾菌體，至真空抽不在滴水，棄去濾紙稱其重量即為菌體的重量。取2瓶的平均值，以時間為橫坐標，菌體量為縱坐標，得到亞麻刺盤孢的生長曲線。

2.2.5 種子液的培養

按種子培養基配方配置種子培養基，分裝于500 ml搖瓶中，每瓶裝200 ml ， 塞紗布之后包牛皮紙，120 ℃滅菌30 min，冷卻。

無菌條件下接種亞麻刺盤孢。

29 ℃、160 rpm/min培養。

2.2.6 投料前培養

按發酵培養基配方配置發酵培養基，分裝于500 ml搖瓶中，每瓶裝200 ml，塞紗布之后包牛皮紙，120 ℃滅菌30分鐘，冷卻。待種子液生長到一定間段，且生長良好，無雜菌。在無菌條件下將種子液按10%的量移種到發酵培養基中，置搖床29 ℃180 r/min培養。

2.2.7 投料時間的確定

移種之后，由生長曲線觀察，觀察菌絲生長良好，鏡檢無雜菌，分別在對數生長期、穩定前期、穩定中期、穩定后期、衰亡期投料。底物用溶劑（水、甲醇、乙醇、DMF）混合投料。

2.2.8 投料量的確定

分別考察投料量為2 g/l、4 g/l、6 g/l、8 g/l、10 g/l、12 g/l、14 g/l。每個投料量考察2個搖瓶。

2.2.9 投料溶劑及倍率的考察

分別考察溶劑為水、甲醇、乙醇、DMF。選擇最優條件后，考察不同倍率投料，

2.2.10 分析方法

發酵液混合均勻，取1 ml發酵液離心，棄去上清，菌絲加入乙酸乙酯，萃取離心取上清檢測。檢測方法采用高效液相色譜（HPLC）檢測DHEA、7α-OH-DHEA、7α，15α-二羥基去氫表雄酮的濃度。

Agilent C18柱，流動相乙腈：水=7：3，柱溫30 ℃，檢測波長206，進樣量為10微升，流速0.5 ml/min.產物計算方法=7α，15α-二羥基去氫表雄酮峰面積/DHEA、7α-OH-DHEA、7α，15α-二羥基去氫表雄酮峰面積。

3 實驗結果與分析

3.1 菌種篩選

由于菌種生長時間較長，培養基滅菌之后倒于平皿之時，需要稍微增加平皿中種子培養基的量，以保證培養后期培養基不會因缺水開裂。

菌種篩選過程簡單，但工作量大，且不能保證篩選的菌種能夠長期穩定的遺傳，需要不斷的進行篩選，待選擇最佳的培養菌種為止。

3.2 菌體生長曲線的測定

制備亞麻刺盤孢孢子懸浮液，接種至種子培養基中搖瓶培養。通過不同培養時間的菌絲體稱重，計算生物量，以培養時間為橫坐標，菌體量為縱坐標，得到生長曲線如圖1所示

由圖1觀察得到，亞麻刺盤孢生長基本呈現潛伏期、對數期、穩定期和衰亡期的趨勢。接種后（0）-（6）h為菌體生長潛伏期，（6）-（18）為對數生長期，（18）-（36）為穩定期，（36）達到最大生物量為31 g/L，之后進入衰亡期。

3.3 投料時間的確定

選擇在不同時期投料，取樣檢測至底物不在消耗為止。以投料時期為橫坐標，轉化率為縱坐標，如圖2所示

如圖2所示，選擇在對數中后期菌體生長12 h左右投料較佳，轉化率可達80%，加底物后繼續轉化培養至發酵結束。最優選擇為生長至12 h投料。

3.4 不同投料溶劑的影響

甾體微生物轉化的一個主要問題是底物和產物在水溶液中的溶解度較低，且底物會被析出產物包裹，影響底物和菌種的接觸，限制最終的轉化。使用溶劑加吐溫投料不但可以使底物在水溶液中的溶解度變大，而且溶劑能夠增加菌體細胞膜的通透性，使底物和酶系更容易接觸。

實驗中使用水、甲醇、乙醇、DMF等生產中比較常見的溶劑。空白對照為不加溶劑，以溶劑為橫坐標，轉化率為縱坐標得到如圖3所示。

以不同溶劑投料，可得到最優溶劑為DMF其轉化率達81%，這是由于物料在DMF中溶解性大，DMF本身對菌體的毒害性較小，故其轉化效果更好，而甲醇與乙醇對菌體有一定的毒害性，會影響菌體生長，水做溶劑時原料溶解性較差不能有效的與菌絲體接觸。

3.5 不同投料濃度的影響

選擇不同投料量，以投料量為橫坐標，轉化率為縱坐標作圖。得到如圖4所示，最優選擇為10 g/L，轉化率達84%。投料濃度越低轉化率越高，但投料濃度過低，降解很嚴重，最后產物也被降解了，收率比較低。當投料量達到10 g/L時候，通過加入表面活性劑等方法仍然可以達到轉化80%以上。

當投料量過大時，底物會抑制菌體生長，且對酶有抑制作用；而且過多底物會在發酵液中結團存在，導致菌絲體無法利用底物；底物轉化為產物后析出由于發酵液中底物濃度過高，產物就會在包裹底物形成顆粒，影響轉化。

3.6 投料溶劑倍率考察

選擇投料溶劑為DMF，依次選擇比例為0、1%、2%、3%、4%、5%（按照裝液量計算）。每批次2個搖瓶。500ml帶刺三口瓶裝液量100ml，以溶劑量為橫坐標，轉化率為縱坐標做圖。如圖5所示。

最優選擇為2%，轉化率達83%。雖然DMF的溶解性較大且毒性較小，但當溶劑量過少時仍有部分底物未溶解，造成轉化未完全；但溶劑量過大時，也會對菌絲體造成損傷，不利于菌絲體生長及轉化。

4 結 語

通過一系列的條件考察，我們最終以葡糖糖30，玉米漿10，磷酸二氫鉀1，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂0.244，泡敵適量（不起泡沫即可）為培養基，最優培養條件為：種子培養條件29℃，

160 rpm/min，發酵培養條件29 ℃，180 rpm/min，最優轉化條件為：種子培養30～36 h，發酵培養為10%移種量培養12～18 h，生長良好，無雜菌使用2倍DMF投料。最終通過亞麻刺盤孢轉化DHEA生成目標產物轉化率可達80%以上。且工藝穩定，通過比例放大驗證工藝可行，適用于大規模工業化生產。

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