金納米簇的制備、表征及對玉米種子萌發的影響

竇潤芝，陳 靜，楊中州，由婷婷，高 翔，王 麗

(東北師范大學遺傳與細胞研究所，吉林 長春 130024)

金納米簇的制備、表征及對玉米種子萌發的影響

竇潤芝，陳 靜，楊中州，由婷婷，高 翔，王 麗

(東北師范大學遺傳與細胞研究所，吉林 長春 130024)

選用模式植物玉米為研究材料，初步評估了金納米簇在植物中的安全性.結果表明：金納米簇對玉米種子發芽率沒有影響，50～400 mg/L的金納米簇能夠促進發芽期間玉米幼苗根和芽的生長.通過切片觀察了金納米簇在玉米幼苗細胞和組織中的吸收情況，發現金納米簇能夠進入玉米根尖脫落細胞以及根部皮層細胞.另外，通過電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)測定了金納米簇在玉米幼苗中的吸收量，證實了金納米簇未從玉米根部向地上運輸.

金納米簇；玉米種子萌發；吸收；運輸

納米材料是指在三維空間中至少有一個維度的尺寸處于1～100 nm之間或由小于100 nm的基本單元組成的材料[1-2].隨著納米科學與技術的快速穩步發展，納米材料已經廣泛應用于農業、醫藥、食品、化妝品、日用品等眾多領域中[3-5].然而在生產、使用和處理等過程中納米材料會不可避免地被傳播到生態環境當中，可能對生物體和生態環境造成不可預知的影響，因而納米材料的環境行為及其毒性效應已經引發研究人員的廣泛關注[6-8].

金納米簇(AuNCs)是一種新型的熒光納米材料，通常由幾個到100個金原子組成，尺寸小于2 nm[9].它們具有熒光強度大、毒性低、水溶性良好、生物相容性高等優點[9-10]，因而在生物傳感和生物成像等方面應用廣泛[11].目前關于金納米簇在細胞中的吸收和毒性研究僅在動物細胞中有報道[12-13]，而對于金納米簇在植物中的吸收和毒性研究尚未見報道.

本文選用USEPA(美國環境保護署)推薦的研究農藥和有毒物質生態效應的模式植物玉米為對象，通過觀察金納米簇對玉米早期萌發和生長的影響，探究了金納米簇在植物中的安全性，并通過切片觀察及等離子體原子發射光譜(ICP-AES)測定研究了金納米簇在玉米細胞和組織中的吸收情況，為金納米簇在植物中的應用提供了理論基礎.

1 實驗部分

1.1 金納米簇的制備、純化與表征

實驗制備和盛裝試劑的玻璃容器均用王水浸泡處理并洗凈晾干.金納米簇的制備參照Xie等[14]的方法：將50 mL的氯金酸(HAuCl4)水溶液(10 mmol/L，37℃)加入到50 mL的牛血清白蛋白(BSA)水溶液(50 mg/L，37℃)中，攪拌5min后加入5 mL的氫氧化鈉(NaOH)水溶液(1 mol/L)，37℃水浴反應12 h.將制得的金納米簇14 000 r/min離心30 min，取上清加入到透析袋(截留相對分子質量為14 000)中透析4 d，之后用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃放置備用.利用JEOL JEM-2100F高分辨透射電子顯微鏡(HR-TEM，日本電子株式會社)、Nano Measure軟件、Zetasizer Nano ZS激光粒度儀(馬爾文儀器有限公司，英國)、Cary Eclipse熒光分光光度計(瓦里安公司，美國)及Thermo Nanodrop 1000分光光度計(Nanodrop，美國)檢測金納米簇的粒徑大小、ζ電勢、熒光以及紫外可見吸收光譜.

1.2 金納米簇對玉米的暴露處理及其對萌發期玉米的影響

玉米種子(鄭單958，北京德農種業有限公司)先用70%乙醇處理2 min，再用無菌水清洗5次.將不同質量濃度的金納米簇(50，100，200，400 mg/L)以5 mL/皿的量加入到培養皿中(含單層濾紙)，每個培養皿均勻地放入10粒種子，每個處理3個重復，空白對照用超純水處理.將培養皿放置于人工氣候室中，設定溫度為25℃，濕度為80%，光照為24 h黑暗.分別統計不同濃度金納米簇處理的玉米種子每天的發芽數，以及金納米簇處理第5天玉米的根長、芽長和鮮重.

1.3 玉米根部細胞壓片、組織切片及熒光顯微觀察

暴露結束后，將玉米根用超純水沖洗，切取根尖(約0.5 mm長)進行壓片處理并在Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡(尼康公司，日本)下觀察.同時取根部成熟區用5%瓊脂糖包埋，利用LEICA VT1000 S振動切片機(徠卡公司，德國)制作橫切切片.

1.4 樣品消解及組織中金元素含量的ICP-AES測定

暴露結束后，將玉米幼苗切分成根和芽兩部分，分別用自來水沖洗并在超純水中超聲5 min；用超純水洗凈并吸干水分，105℃殺青15 min，70℃烘干至恒重.

將烘干的樣品磨成粉末，取干樣0.05 g置于100 mL錐形瓶中，向其中加入5 mL濃硝酸(HNO3)，用保鮮膜封口，浸泡過夜，每個濃度3個重復.把錐形瓶轉移到電熱板上，120℃加熱1 h后，加1 mL王水浸泡1 h；之后將其置于65℃烘箱中繼續溶解1 h.將瓶內液體吸出定容至1.5 mL，利用ICP-AES(Aodigy型，利曼公司，美國)檢測金元素含量.空白設置：加等量的濃硝酸，操作同樣品.

1.5 分析方法

實驗數據統計分析采用軟件SPSS 19.0，用ANOVA(analysis of variance，Tukey-HSD檢驗法)進行差異顯著性檢驗(P<0.05).

2 結果與分析

2.1 金納米簇的表征

制備的金納米簇在高分辨透射電子顯微鏡(HR-TEM)下呈圓球形顆粒，平均粒徑為(2.05±0.41)nm(見圖1a，b).金納米簇在紫外-可見范圍內并沒有特征的吸收峰(見圖1c)，利用熒光分光光度計檢測得的熒光光譜顯示金納米簇在480 nm激發下于638 nm處有吸收峰(見圖1c)，且在紫外燈(365 nm)下呈鮮紅色(見圖1d).利用Zetasizer Nano ZS激光粒度儀測得金納米簇的ζ電勢為(-14.70±0.96) mV，表明金納米簇帶負電荷.

a金納米簇的HR-TEM圖像；b金納米簇的粒徑分布圖；c金納米簇的UV-Vis吸收(黑線)及熒光光譜(紅線，激發波長為480 nm)；d日光和紫外燈(365 nm)下的金納米簇

2.2 金納米簇對玉米萌發的影響

不同質量濃度的金納米簇處理玉米種子5 d后的形態見圖2a.以玉米根長超過2 cm作為發芽標準[15]，發現 50～400 mg/L的金納米簇對玉米的發芽率沒有影響.統計金納米簇處理玉米5 d后的根長和芽長發現，100，200，400 mg/L的金納米簇對玉米根的伸長有促進作用，與對照相比分別增加了18.37%，20.87%和18.26%(見圖2b)；而4個質量濃度(50，100，200，400 mg/L)的金納米簇對芽的伸長均有促進作用，與對照相比分別增加了21.19%，24.86%，21.19%和22.60%(見圖2c).

通過分析金納米簇處理玉米5 d后根與芽的鮮重發現，所有濃度的金納米簇對根的鮮重均沒有影響(見圖2d)；但對芽的鮮重有促進作用，與對照相比50，100，200，400 mg/L的金納米簇處理玉米5 d后芽的鮮重分別增加了11.88%，20%，15%和24.38%(見圖2e).

a不同質量濃度金納米簇處理玉米種子5 d后的形態；b根長；c芽長；d根鮮重；e芽鮮重

2.3 玉米對金納米簇的吸收及運輸

2.3.1 玉米幼根壓片及切片

分別對超純水和400 mg/L金納米簇處理第三天的玉米幼根根尖(約0.5 mm)進行壓片，發現400 mg/L 金納米簇處理后的玉米根尖脫落細胞中存在紅色熒光物質(見圖3a，b)，說明金納米簇可以穿透玉米細胞的細胞壁和細胞膜，進入根尖脫落細胞內.同時我們對玉米幼根進行橫切，在金納米簇處理的玉米根成熟區的皮層細胞中也觀察到了少量紅色熒光物質(見圖3c，d)，說明金納米簇能夠進入玉米根部.

a超純水處理的玉米第3天的根部細胞壓片(40×物鏡)；b 400 mg/L金納米簇處理的玉米第3天的根部細胞壓片(40×物鏡)；

2.3.2 玉米體內金元素含量的測定

圖4 ICP-AES測定玉米根部組織中的金元素含量

利用ICP-AES對玉米根和芽中的金元素含量進行測定，結果見圖4.由圖4可見，對照組的根中未檢測到金元素的存在；金納米簇處理5 d后的玉米根系中金元素的含量隨著處理濃度的增加而升高，最大質量濃度400 mg/L金納米簇處理的玉米根系中金含量(1 604.11 μg/g)是50 mg/L 處理(57.90 μg/g)的27.7倍.而在玉米芽中，ICP-AES的結果顯示未檢測到金元素的存在.

3 討論

許多研究表明納米材料對植物的萌發率沒有影響，但是對其生長和發育卻能產生影響[16].如檸檬酸包被的金納米粒子在較低濃度就能抑制水稻根的伸長，但是對水稻種子的萌發率沒有影響[17].本研究發現，金納米簇對玉米種子的萌發率未產生影響，但是一定濃度的金納米簇能夠促進發芽期間玉米幼苗根和芽的生長.Kumar等[18]的研究發現，10和80 μg/mL的金納米粒子(24 nm)能下調參與種子萌發、幼苗生長以及根伸長的miR( microRNA )398和miR408的表達從而促進擬南芥的營養生長.我們推測金納米簇促進玉米幼苗生長的原因可能是金納米簇改變了一些與玉米生長發育相關的miR的表達.

粒徑是納米粒子重要的特征，也是進入植物體并產生生物學效應的關鍵因素.與動物細胞相比，植物細胞多了一層細胞壁(孔徑≤10 nm)[19-20]，有報道表明，小粒徑的納米粒子可以進入到植物細胞[21-23].我們的課題組已經報道了粒徑在3 nm左右的碳量子點可以進入玉米根部細胞[23]，本實驗同樣在玉米根尖脫落細胞中觀測到了金納米簇的存在，這可能是由于3 nm的金納米簇粒徑小于細胞壁孔徑導致的結果.

利用ICP-AES在玉米根中能檢測到大量金元素的存在，而利用熒光顯微鏡僅能在玉米根中的皮層細胞中檢測到少量金納米簇的存在，結合金納米簇能夠被過氧化氫淬滅[24]，推測玉米根中被吸收的金納米簇的熒光可能被組織中的過氧化氫淬滅，也有可能是植物組織中的其他成分改變了金納米簇的表面結構致使其熒光性質改變.

在金納米簇暴露下的玉米，其根中可以檢測出金元素,而在其地上部分并未發現,說明金納米簇在玉米體內不能向地上運輸.金納米簇不能從玉米根組織進一步運輸到芽可能是受到玉米內皮層凱氏帶的阻礙，因而金納米簇無法進入維管束隨著水分向上運輸.這與Wang等[25]的研究結果一致：CdSe/CdZnS量子點能夠被楊樹根部吸收但不能運輸到地上部分.

本實驗探究了金納米簇對玉米種子萌發的影響，發現這種納米材料對玉米早期萌發階段根和芽的生長有促進作用，但其作用機制仍需進一步研究.

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(責任編輯：方 林)

Fabrication and characterization of gold nanoclusters and their effects on maize(ZeamaysL.) seed germination

DOU Run-zhi，CHEN Jing，YANG Zhong-zhou，YOU Ting-ting，GAO Xiang，WANG Li

(Institute of Genetics and Cytology，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

Maize，as a model plant，was chosen in this research to assess the safety of gold nanoclusters in plants.The results showed that gold nanoclusters had no effect on germination rate of maize seeds.However，gold nanoclusters at 50～400 mg/L could significantly promote the elongation of roots and shoots during the germination.The fluorescence of gold nanoclusters in the cells and tissue of maize roots was tracked by slicing and fluorescent microscope.Fluorescent microscope graphs showed that gold nanoclusters were existed in detached root-cap cells and cortex of roots，suggesting that gold nanoclusters were absorbed by maize.Moreover，the content of gold element in maize was determined by inductively coupled plasma atomic emission spectrometer(ICP-AES)，which suggested that gold nanoclusters can not be translocated to the shoots from the roots of maize.

gold nanoclusters; maize seed germination; uptake; transport

1000-1832(2016)04-0100-06

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.04.022

2016-05-06

國家國際科技合作專項項目(2014DFA31740)；吉林省科技發展計劃項目(20130604037TC).

竇潤芝(1992—)，女，碩士研究生；王麗(1957—)，女，博士，教授，博士研究生導師，主要從事植物遺傳學研究.

Q 943 [學科代碼] 180·5155

A